Ссылка на файл: >>>>>> http://file-portal.ru/Методы культивирования вирусов их индикация и идентификация/
Методы выделения, культивирования и идентификации вирусов
Методы культивирования, индикации и идентификации вирусов. Методические рекомендации по организации самостоятельного изучения курса «Общая вирусология» (стр. 1 )
Методические рекомендации по организации самостоятельного изучен
Методы культивирования, индикации и идентификации вирусов: В методических рекомендациях представлены современные методы исследования вирусов. Описываются особенности работы с вирусами, методы их культивирования, индикации и идентификации. Согласно учебному плану по специальности Вирусология — медико-биологическая наука, изучающая вирусы: В результате изучения вирусологии студенты должны знать особенности вирусов, овладеть практическими навыками и умениями в заборе материала для вирусологических исследований, проведении лабораторных методов диагностики заболеваний и в оценке их результатов. При изучении вирусологии используются знания, полученные студентами при прохождении общей биологии, гистологии , биохимии, генетики, физиологии. Согласно учебно-тематическому плану на освоение вирусологии отводится 38 часов, из которых 10 часов аудиторных и 28 часов на самостоятельную работу. Существующие учебники и практические руководства не отражают всех вопросов, затрагиваемых в этом курсе. Настоящие методические рекомендации разработаны по темам соответствующим лабораторным занятиям и содержат методы не представленные в лабораторном практикуме. Основное внимание уделено современным методам применяемым в вирусологии, вместе с тем студенты знакомятся с фундаментальными принципами и нюансами вирусологических методов исследования. В данное издание включены разделы: К каждому разделу даётся перечень контрольных вопросов, тематика докладов о результатах самостоятельной работы и список рекомендуемой литературы. В вирусологической лаборатории проводят работу по выделению штаммов вирусов, их идентификации и культивированию, выполняются различные научные исследования. При работе с вирусами необходимо прежде всего:. Обеспечить безопасность окружающего населения от заражения вирусными инфекциями через сточные воды, трупы экспериментальных животных и т. Методы исследования, применяемые в вирусологии отличаются значительной сложностью, что связано прежде всего с абсолютным внутриклеточным паразитизмом вирусов и их малыми размерами. При исследовании материалов, полученных от больных вирусными инфекциями, с целью лабораторной диагностики этих заболеваний применяются различные методы:. При взятии инфекционного материала от людей и животных необходимо учитывать тропизм вирусов к определённым тканям и органам, пути выделения вируса во внешнюю среду и особенности патогенеза той или иной вирусной инфекции. Различают пневмотропные, энтеротропные, гепатотропные, лимфотропные, нейротропные и дермотропные вирусы. В зависимости от тропизма исследованию подвергают различные материалы. Например, исследуют слизь из зева, мокроту и т. Инфекционные материалы, взятые с учётом тропизма вирусов и с соблюдением асептики, помещают в стерильную посуду, тщательно закупоривают её и направляют в лабораторию, поместив в термос со льдом. Материал рекомендуется исследовать в кратчайший срок, так как вирусы быстро инактивируются. Но самый надёжный способ — это хранение в замороженном состоянии при температуре оС и ниже; в таких условиях вирус может оставаться жизнеспособным длительное время. Обработка плотного материала, содержащего вирусы, начинается с растирания его в ступке или измельчения в специальных аппаратах — гомогенизаторах. Вирусы остаются в надосадочной жидкости, которую и подвергают дальнейшему исследованию. Жидкий вируссодержащий материал непосредственно центрифугируют и также получают надосадочную жидкость. Если есть сомнения в бактериологической стерильности исследуемой вируссодержащей надосадочной жидкости, к ней добавляют антибиотики , чтобы уничтожить посторонние микроорганизмы. Антибиотики не влияют на вирусы, и они сохраняют свою жизнеспособность. Электронноскопические препараты готовят из очищенных и концентрированных вируссодержащих взвесей или ультратонких срезов тканей, заражённых вирусами. Вирусные объекты наносят на специальные плёнки-подложки, помещённые на опорные сеточки. Плёнки-подложки должны быть очень тонкими не более 30 нм толщины , прозрачными и достаточно прочными, например, коллоидийно-угольные. Плёнки наносят на поддерживающие сеточки из меди диаметром мм с многочисленными отверстиями. Далее препараты обрабатывают различными способами. Методы напыления металлами применяют для получения контрастных препаратов. Пары тяжёлых металлов золота, платины, урана и др. Вирусы оказываются покрытыми тонким слоем металла. Метод ультратонких срезов в сочетании с негативным контрастированием является наилучшим для изучения тонкого строения вирионов и изучения этапов взаимодействия вирусов с клеткой, но в то же время он наиболее сложен. Исследуемые кусочки инфицированной ткани или другого вируссодержащего материала фиксируют в специальном фиксаторе например, осмиевом. Обезвоживают путём последовательного помещения в спирты возрастающей крепости. Заливают образцы специальной пластмассой, после полимеризации которой образуются твёрдые прозрачные блоки. Из блоков готовят ультратонкие срезы толщиной нм на специальном микротоме, Полученные срезы контрастируют, помещая в раствор фосфорно-вольфрамовой кислоты. Приготовленные вышеописанными способами препараты изучают в просвечивающем электронном микроскопе, разрешающая способность которого достигает 0,,3 нм. Изображение препарата наблюдают на флюаресцирующем экране электронного микроскопа и фотографируют специальные фотопластинки, с которых получают отпечатки. Сканирующая электронная микроскопия осуществляется с помощью сканирующего электронного микроскопа, в котором тонкий пучок электронов быстро перемещается по исследуемому объекту, то есть сканирует его поверхность. В результате возникает излучение вторичных электронов, которое, проходя через катодно-лучевую трубку, преобразуется в объёмное изображение объекта на флюоресцирующем экране. Сканирующая микроскопия позволяет получать трёхмерное изображение вирионов предварительно препарат напыляют металлами , различать детали строения их поверхности, но не выявляет их внутреннюю структуру. Разрешающая способность сканирующего микроскопа равна нм. В световом микроскопе можно увидеть крупные вирусы, размеры которых находятся в пределах разрешающей способности микроскопа - не менее 0,2 мкм. А также внутриклеточные включения в поражённых вирусом тканях. Крупные вирусы, например, поксвирусы, и включения обнаруживают с помощью специальных методов окраски, в фазовом контрасте, в тёмном поле зрения; применяют и люминесцентную микроскопию. Крупные вирусы выявляют путём окраски по Морозову серебрением. Для выявления внутриклеточных включений приготавливают гистологические срезы из поражённых тканей, препараты-мазки или отпечатки. Обычно препараты окрашивают по Романовскому-Гимзе, иногда другими методами. Наибольшее практическое значение имеет обнаружение включений Бабеша-Негри в нервных клетках головного мозга при бешенстве. Для этого препараты окрашивают по Манну. Препараты, приготовленные из материалов, содержащих крупные вирусы, внутриклеточные включения, скопления вирусных антигенов , окрашивают растворами флюорохромных красителей. При люминесцентной микроскопии в УФ-свете окрашенные акридин-оранжевым скопления РНК-геномных вирусов и образуемые ими включения видны как светящиеся красные гранулы на фоне бледно-зелёной цитоплазмы клеток; ДНК-геномные вирусы дают изумрудно-зелёное свечение. Иммунофлюоресцентный метод основан на соединении вирусов, внутриклеточных включений, скоплений вирусных антигенов со специфическими противовирусными антителами , меченными флюорохромными красителями. Образовавшиеся комплексы дают свечение при люминесцентной микроскопии. Культура клеток — клетки какой-либо ткани животных или человека, способные расти и размножаться в искусственных условиях. Культуры клеток широко применяются при диагностике вирусных инфекций, в производстве вакцин , незаменимы при проведении научных исследований в области вирусологии. Для успешного получения клеточных культур и последующего размножения в них вирусов культивируемые клетки должны постоянно находиться в сбалансированной физиологической среде, содержащей все необходимые компоненты для их жизнедеятельности и размножения. Питательные потребности клеток обеспечиваются наличием незаменимых аминокислот таких, как глутамат, лейцин, изолейцин, валин, фенилаланин, аргинин, гистидин, метионин, треонин, цистин, тирозин , витаминов особенно комплекса В , глюкозы и сыворотки крови. Изотоничность и буферность среды поддерживается с помощью неорганических солей. Оптимальным является рН 7,,4, при длительном культивировании клеток значение рН должно оставаться в пределах 6,,8. Постоянство рН в течение нескольких дней обеспечивается присутствием карбонатного и фосфатного буферов. Стабилизации значения рН способствует выращивание культур в пробирках и флаконах, закрытых резиновыми пробками, вследствие чего не улетучивается СО2 в противном случае это привело бы к сдвигу рН в щелочную сторону. Контроль за реакцией среды осуществляется путём добавления индикатора фенолрот: Во время приготовления клеточных культур к солевым растворам и питательным средам нередко добавляют антибиотики, чтобы избежать бактериального и грибкового загрязнения. Для приготовления питательной среды требуется вода высокой степени очистки, так как культура клеток очень чувствительна к ионам тяжёлых металлов. Рекомендуется применять бидистиллированную воду, перегнанную в стеклянных аппаратах или очищенную в ионообменных колонках. Питательные среды для клеточных культур в большинстве случаев готовят на основе солевых растворов, которые имеют состав солей, качественно и количественно приближающийся к составу жидкостей животного организма. Естественные питательные среды готовят на основе солевых растворов Хенкса и Эрла, к которым добавляют сыворотку, амниотическую жидкость, эмбриональный экстракт. Эти биологические жидкости являются источниками белкового питания, витаминов и других веществ, способствующих росту и размножению клеток. Например, среда для культивирования клеток HeLa: В среды добавляют ферментативные гидролизаты: Среда Паркера содержит 20 аминокислот,17 витаминов, пурины и пиримидины, глюкозу, 9 минеральных солей и ряд других веществ. Эту среду готовят на солевом растворе Хенкса, стерилизуют фильтрованием через бактериальные фильтры. Среда Игла содержит 13 аминокислот, 4 катиона, 3 аниона, 6 витаминов, холин, инозит и углеводы. Для приготовления культур клеток используют различные ткани животных, человека и птиц как эмбриональные, так и зрелые. Кроме нормальных используют и злокачественные перерождённые ткани, получаемые из опухолей. Источником эмбриональной ткани часто служит куриный зародыш, а также эмбрионы человека, мышей, свиней, кроликов и др. Эмбриональная и опухолевая ткани отличаются лучшей выживаемостью и более активным ростом, чем ткани взрослого организма. Из зрелых тканей чаще всего употребляется почечная ткань обезьян, морских свинок, хомячков и др. Ткани берут в асептических условиях, промывают в солевом растворе Хенкса и затем подвергают измельчению. В вирусологии используют только культуры растущих тканей, которые подразделяют на:. В практической вирусологии чаще используют однослойные культуры , клетки которых растут и размножаются будучи прикреплёнными к твёрдому субстрату стеклу, пластику , образуя слой толщиной в одну клетку монослой. Метод обработки однослойных культур клеток основан на обработке исходной ткани ферментами обычно трипсином , разрушающими межклеточные связи; ткань диспергируется, и образуется взвесь изолированных клеток. При культивировании клетки прикрепляются к стеклу сосуда и растут в виде сплошного монослоя, благодаря чему удобно воздействовать на клетки, заражая их вирусами, и визуально наблюдать возникающие изменения в динамике. Яйца, инкубированные дней, овоскопируют. Убедившись в жизнеспособности эмбриона, очерчивают границу воздушного мешка. Скорлупу на тупом конце яйца протирают спиртом, йодом, снова спиртом, а затем срезают на уровне воздушного мешка. Извлекают эмбрион и помещают его в стерильную чашку, удаляют голову. Тело эмбриона омывают мл раствора Хенкса, который затем отсасывают. Тело эмбриона тщательно измельчают ножницами, полученные кусочки размером около 1 мм3 пипеткой переносят в пробирку. Проводят кратное отмывание измельчённой ткани от крови. Каждый раз наливают в пробирку с тканью по мл раствора, дают ткани осесть, после чего жидкость отсасывают. Под действием трипсина клетки ткани разъединяются и образуют суспензию, поэтому после оседания более крупных тканевых частиц на дно пробирки жидкость над осадком должна остаться мутной. Верхний помутневший слой жидкости, содержащий взвесь изолированных клеток, переносят в центрифужную пробирку, куда заранее наливается 2,5 мл питательной среды гидролизата лактальбумина. Надосадочную жидкость удаляют, к осадку клеток добавляют мл гидролизата лактальбумина и тщательно перемешивают, чтобы клетки вновь оказались во взвешенном состоянии. Для отделения конгломератов клеток, которые могут попасть во взвесь, рекомендуется последующее фильтрование через сетку из нержавеющей стали или марлю. Производится подсчёт клеток в камере Горяева под малым увеличением микроскопа. Взвесь разливают в пробирки по 1 мл, закрывают резиновыми пробками и помещают в термостат при С в наклонном положении под углом Через суток от начала культивирования, просматривая пробирки при малом увеличении микроскопа, можно видеть вытянутые, отростчатые клетки — фибробласты, которые растут на стенке пробирки, образу монослой. Это стабильные культуры клеток, которые способны бесконечно долго размножаться вне организма, если их культивировать в соответствующих условиях. Например, перевиваемые культуры из амниона человека FL, А-8 , почки обезьян VERO - от зелёной мартышки, LLCMK 2 — от макаки-резус , эмбриона мыши ЗТЗ , из опухолевых клеток человека HeLa - из рака шейки матки, Нер—2 — из рака гортани и многие другие. Перевиваемые культуры клеток обладают целым рядом преимуществ по сравнению первичными. Работа с ними менее трудоёмка, они отличаются большим диапазоном чувствительности ко многим вирусам. Однако перевиваемые культуры не пригодны для производства вирусных вакцин, так как существуют опасения по поводу их возможной злокачественности. Перевиваемые культуры клеток без пересева на свежую среду довольно быстро дегенерируют. Поэтому исходную культуру клеток выращивают в матрацах с питательной средой, еженедельно пересевая культуру в новые сосуды. При работе с пробирочными культурами также рекомендуется пересевать их через дней, или же раз в дня заменять питательную среду свежей, тогда клеточные культуры сохраняют свою жизнеспособность недели. Их называют полуперевиваемыми культурами, так как ини обладают способностью к пересевам в течение длительного времени — выдерживают до пассажей, проводимых на протяжении месяцев. Затем культура клеток дегенерирует и гибнет. Диплоидными их называют, потому что они стойко сохраняют диплоидный кариотип, присущий исходным нормальным клеткам организма — родоначальницам диплоидной линии. Культуры диплоидных клеток получают из различных тканей эмбриона человека, из первичных культур. Так, например, пользуется известностью штамм ДКЛЧ диплоидные клетки лёгких человека , штаммы WJT, JMR, MRC-5 из лёгких ткани эмбриона человека. Диплоидные культуры применяют для выделения и культивирования вирусов. Они чувствительны ко многим штаммам вирусов, онкогенно безопасны, пригодны для культивирования в промышленных масштабах и получения массового количества вирусных вакцин. Суспензированная культура — это культура, в которой отдельные клетки или их конгломераты постоянно находятся во взвешенном состоянии в жидкой среде. Культуры клеток в суспензии удаётся получить, если проводить их культивирование при постоянном интенсивном перемешивании среды путём вращения пробирок в барабане, с помощью магнитной мешалки и т. В последнее время используют специальные аппараты — хемостаты, в которых обеспечивается автоматическое обновление среды. Суспензированные клетки обладают большей активностью роста, накапливаются в большом количестве, при регулярной замене среды длительное время остаются жизнеспособными. Многие вирусы, поражающие человека и животных, могут в большей или меньшей степени размножаться в курином эмбрионе. Наличие плотной скорлупы защищает эмбрион от попадания микроорганизмов из внешней среды. Метод культивирования вирусов в куриных эмбрионах используют при лабораторной диагностике вирусных инфекций, а также для изготовления вирусных вакцин и диагностических препаратов. Но этот метод имеет недостатки: Несмотря на имеющиеся недостатки метод сравнительно прост, удобен и дешев и широко используется в вирусологических исследованиях. Наибольшее значение он имеет при работе с ортомиксовирусами, герпесвирусами, поксвирусами. Куриный эмбрион покрыт известковой оболочкой — скорлупой, к которой изнутри примыкает скорлупная оболочка. В тупом конце яйца она раздваивается и заключает в себе воздушное пространство. Под скорлупной оболочкой находится хорионаллантоисная оболочка, в тупом конце яйца она проходит по внутренней стороне скорлупной оболочки, замыкающей воздушное пространство, эта оболочка богата кровеносными сосудами и служит эмбриону органом дыхания. Изнутри к ней прилегает аллантоисная полость, которая является органом выделения и защищает зародыш от высыхания и травм. Аллантоисная полость окружает зародыш, находящийся в полости амниона, которая наполнена околоплодной жидкостью. Через желточный канатик зародыш соединён с желточным мешком — основным источником питательных веществ. Заражают куриные эмбрионы определённого возраста, инкубированные от 6 до 13 дней в зависимости от вида вирусов и метода заражения. Инструменты помещают в стаканчик со спиртом, где они находятся в течение всей работы, перед каждой манипуляцией их дополнительно стерилизуют обжиганием в пламени горелки. Руки перед работой тщательно моют, рекомендуется надеть маску из марли. Для работы отбирают жизнеспособные эмбрионы, просвечивая инкубированные яйца в овоскопе. Жизнеспособный эмбрион подвижен, кровеносные сосуды оболочки заполнены кровью. Отобранные яйца тщательно дезинфицируют на тупом конце или на боковой стороне яйца: Яйцо помещают на подставку в вертикальном положении так, чтобы воздушный мешок находился наверху, проводят стерилизацию скорлупы на тупом конце яйца. Через отверстие осторожно надрывают иглой внутренний листок скорлупной оболочки и отслаивают на небольшом участке 0, см2. Производят заражение хорионаллантоисной оболочки путём нанесения на неё 0,,2 мл вируссодержащего материала с помощью пастеровской пипетки или шприца. Окошко в скорлупе закрывают специальной эластичной плёнкой или стерильным покровным стеклом и прикрепляют расплавленным парафином. Заражённые эмбрионы помещают в термостат в вертикальном положении и инкубируют в течение суток, после чего производят вскрытие по следующим правилам:. Яйцо помещают на подставку так, чтобы воздушное пространство было наверху, проводится стерилизация места вскрытия. Пользуясь пинцетом, снимают скорлупную оболочку по границе. Обнажённую хорионаллантоисную оболочку подрезают вдоль края скорлупы. Через образовавшееся отверстие выливают всё содержимое яйца в чашку или лоток. Оставшуюся внутри скорлупы хорионаллантоисную оболочку осторожно извлекают пинцетом и помещают в стерильную чашку с физиологическим раствором. Здесь её расправляют и изучают изменения, поместив чашку на тёмный фон. Для получения из хорионаллантоисной оболочки материала, содержащего вирус, её нужно измельчить ножницами и затем растереть в ступке с кварцевым стеклом, добавив солевой раствор. Методы культивирования, индикации и идентификации вирусов. Методические рекомендации Методички Предприятия Методы Восток Вирусы. Рекомендовано РИС университета УДК Подготовка материала для вирусологических исследований 1. Правила работы в вирусологической лаборатории В вирусологической лаборатории проводят работу по выделению штаммов вирусов, их идентификации и культивированию, выполняются различные научные исследования. При работе с вирусами необходимо прежде всего: Не допустить загрязнения штаммов вирусов посторонней микрофлорой; 2. Обеспечить безопасность работающего персонала от возможного заражения вирусами; 3. При исследовании материалов, полученных от больных вирусными инфекциями, с целью лабораторной диагностики этих заболеваний применяются различные методы: Подписаться на рассылку Pandia. Интересные новости Важные темы Обзоры сервисов Pandia. Основные порталы, построенные редакторами. Бизнес и финансы Бизнес: Каталог авторов частные аккаунты. Все права защищены Мнение редакции может не совпадать с мнениями авторов. Минимальная ширина экрана монитора для комфортного просмотра сайта: Мы признательны за найденные неточности в материалах, опечатки, некорректное отображение элементов на странице - отправляйте на support pandia. Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах: О проекте Справка О проекте Сообщить о нарушении Форма обратной связи. Авторам Открыть сайт Войти Пожаловаться. Архивы Все категории Архивные категории Все статьи Фотоархивы. Лента обновлений Педагогические программы. Правила пользования Сайтом Правила публикации материалов Политика конфиденциальности и обработки персональных данных При перепечатке материалов ссылка на pandia.
Международный суд оон статус
Рыбалка где лучше ловить рыбу
Значение детского труда
Индикация и идентификация вирусов при различных методах культивирования
Просто кто то тебя тихонько любит стихи
Ремонт материнской платы ноутбука своими руками
Оформление визы в чехию самостоятельно
47. Методы культивирования вирусов, принципы их индикации и идентификации
Сетка радиатора своими руками
Федеральный закон о порядке рассмотрения обращений граждан
Методы культивирования и индикации вирусов
Форма договора пожизненной ренты
Пушкина 43 пенза на карте
Скачать майкрософт визуал 2013 64 бит
Методы культивирования, индикации и идентификация вирусов
Значение социального менеджмента