Индикация вирусов в культуре клеток осуществляется, прежде всего, по цитопатическому действию ЦПД вирусов, сроки и характер которого зависят от свойств вируса, проявляясь дегенеративными изменениями клеток с последующей их гибелью и отслаиванием от стекла рис. Полная дегенерация клеток сопровождается значительными изменениями в виде пикноза ядра и цитоплазмы, отслаиванием клеточного монослоя от стекла. Частичная дегенерация культур клеток может протекать по следующим типам:. Пролиферативный тип ЦПД с трансформацией клеток в злокачественные, обладающие неограниченными потенциями к росту, способны вызывать онкогенные вирусы. Сроки, в течение которых наступает ЦПД, вариабельны например, дня у полиовирусов, суток у аденовирусов. Культура клеток почек обезьян а — незараженная, б — цитопатическое действие вируса х Индикация вирусов с помощью реакции гемадсорбции РГад. Сущность этой реакции заключается в способности эритроцитов человека или животных адсорбироваться на поверхности клеток, инфицированных рядом вирусов например, орто и парамиксовирусов и др. Индикация вирусов по цветной пробе. Принцип метода основан на определении кислых продуктов метаболизма, накаливающихся в клетке в процессе ее жизнедеятельности с помощью индикатора фенолового красного, меняющего свой цвет с красного в щелочной среде на оранжево-желтый в кислой среде. При заражении культуры клеток вирусами, вызывающими ЦПД например, аденовирусы, энтеровирусы и др. Индикация вирусов по внутриклеточным включениям. Включения выявляют путем световой микроскопии культур клеток, окрашенных по Романовскому- Гимзе или другими методами, а также с помощью прямого флюорохромирования например акридиновым оранжевым с последующей микроскопией препаратов в люминесцентном микроскопе. Индикация вирусов с помощью электронно-микроскопического метода ЭММ применяется, в основном, в научных исследованиях. ЭММ позволяет обнаружить в ядре или цитоплазме клеток отдельные вирионы, а также их скопления. Количество бляшек отражает инфекционную активность вируса. Для постановки этой пробы вирусную суспензию в разных разведениях вносят в культуры ткани, находящиеся в плоских сосудах, после чего монослой клеток заливают гелем слой агара или бентонита с индикатором нейтральным красным. Время бляшкообразования для большинства вирусов, обладающих ЦПД, варьирует от 36 до 48 ч. Бляшки выглядят в виде неокрашенных светлых пятен на розово-красном фоне окрашенного монослоя. В бентонитовом методе монослой клеток молочного цвета, бляшки прозрачные. Индикация вирусов в куриных эмбрионах. Зараженные РКЭ инкубируют в термостате при 37 0 С в течение 48 ч. В аллантоисной и амниотической жидкости зараженных эмбрионов ряд вирусов например, ортомиксовирусы, парамиксовирусы, аденовирусы и т. В контроле к 0,5 мл ФР добавляют аналогичный объем взвеси эритроцитов. Пробы учитывают через мин инкубации при комнатной температуре, в термостате при 37 0 С или в холодильнике при 4 0 С. Определение титра вирусов можно проводить также на хорионаллантоисной оболочке. Реакция гемагглютинации для выявления вируса гриппа в хорион-аллантоисной жидкости куриного эмбриона. Индикация вирусов в организме лабораторных животных находится в зависимости от вируса и вида чувствительного лабораторного животного, будет описана в лабораторной диагностике конкретных вирусных инфекций. Изучение антигенных свойств вирусов в серологических реакциях с противовирусными сыворотками является основным методом идентификации вирусов. Для этого используют ряд иммунологических реакций. Реакция нейтрализации основана на способности антител нейтрализовать инфекционную активность вирусов в культурах ткани, РКЭ, чувствительных лабораторных животных. По результатам РН высчитывается индекс нейтрализации ИН - отношение титра вируса в контроле к титру вируса в опыте. При ИН менее 10 реакция расценивается как отрицательная, от 11 до 49 — сомнительная, от 50 и выше — положительная. РН может быть поставлена в наиболее чувствительном варианте - подавления вирусного бляшкообразования под действием вирусспецифической антисыворотки. Идентичность вируса антителам сыворотки проявляется подавлением бляшкообразования. Другим вариантом РН является цветная проба. Смесь выдерживают при комнатной температуре мин, добавляют в каждую пробирку по 0,25 мл клеточной суспензии и закрывают их резиновыми пробками. РТГА используется как для определения антител в качестве метода серологической диагностики, так и для идентификации вирусов, обладающих гемагглютининами. Смесь снова инкубируют мин и производят учет результатов реакции. Титром сыворотки считают ее наибольшее разведение, которое вызывает торможение гемагглютинации. Для постановки реакции по 0,2 мл специфической сыворотки, разведенной 1: Контрольные пробы содержат неиммунную сыворотку и эритроциты. Пробирки снова инкубируют мин, после чего производят учет реакции. Для студентов недели бывают четные, нечетные и зачетные. Генетика бактерий и вирусов Встроенные системы контроля и индикация основных параметров в распределительных сетях. Выделение вирусов на экспериментальных животных. Выделение и индикация вирусов на РКЭ. Выделение и культивирование вирусов ГЕНЕТИКА ВИРУСОВ Защита от известных вирусов Защита от известных вирусов Защита от неизвестных вирусов Защита от неизвестных вирусов Защита от проявлений вирусов Идентификация вирусов. Но предоставляет возможность бесплатного использования. Есть нарушение авторского права? Для выявления индикации вирусов применяются следующие методы. Частичная дегенерация культур клеток может протекать по следующим типам: Культура клеток почек обезьян а — незараженная, б — цитопатическое действие вируса х Индикация вирусов с помощью реакции гемадсорбции РГад.
Методы культивирования, индикации и идентификации вирусов. Методические рекомендации по организации самостоятельного изучения курса «Общая вирусология» (стр. 2 )
Яйцо помещают на подставку тупым концом кверху и проводят стерилизацию скорлупы над воздушным пространством. В отверстие вводят иглу шприца, содержащего разведение вируса. Иглу продвигают в вертикальном направлении на мм ниже уровня воздушного мешка и затем вводят 0,,2 мл материала. Заражённые эмбрионы выдерживают в термостате обычно в течение 2 суток. Перед вскрытием яйца помещают на ночь в холодильник при 40С. Вскрытие производится в следующем порядке:. Яйцо устанавливается на подставке так, чтобы воздушный мешок находился наверху, скорлупу над ним стерилизуют. Осторожно удаляют пинцетом скорлупную оболочку, после чего хорионаллантоисную оболочку прокалывают пастеровской пипеткой в том месте, где нет сосудов, и насасывают аллантоисную жидкость. Аллантоисную жидкость переносят в стерильную пробирку, а часть засевают в бульон для проверки на бактериологическую стерильность. Для заражения используют эмбрионы дневного возраста. Заражение в амниотическую полость проводят открытым или закрытым методом. Над центром воздушного пространства в скорлупе ножницами вырезают окошко величиной 2 см в поперечнике. Осторожно снимают внутренний листок скорлупной оболочки с помощью пинцета, обнажая подлежащую хорионаллантоисую оболочку. Прорезают ножницами небольшое отверстие в хорионаллантоисной оболочке в том месте, где нет кровеносных сосудов, и вводят в прорез глазной пинцет. Пинцетом захватывают оболочку амниона и вытягивают амниотический мешок над поверхностью хорионаллантоисной оболочки. Удерживая амниотическую оболочку в этом положении, производят заражение в полость амниона, вводя шприцем 0,,2 мл разведения вируса. Отверстие в скорлупе закрывают стерильным покровным стеклом, пользуясь для фиксации и герметизации яйца расплавленным парафином. Заражённые эмбрионы инкубируют в течение 2 суток, выбраковывая погибшие в течение первых суток. Затем эмбрионы выдерживают в течение ночи в холодильнике при 40С. Простерилизовав место предстоящего вскрытия, срезают скорлупу немного выше края воздушного мешка. Прокалывают хорионаллантоисную оболочку пастеровской пипеткой и удаляют аллантоисную жидкость. Захватив пинцетом амниотический мешок, прокалывают его оболочку иглой шприца или пастеровской пипеткой и насасывают амниотическую жидкость от 0,5 до 1,5 мл. У заражённого эмбриона жидкость должна быть мутной, между тем как у нормального эмбриона она прозрачна. Взятую жидкость переносят в стерильную пробирку. Восприимчивые к изучаемым вирусам животные называются экспериментальной моделью. Взятые в опыт животные должны быть одного вида, определённого возраста и содержаться в одинаковых условиях. Они обладают однотипной наследственностью, имеют минимальное число латентных инфекций, обладают высокой восприимчивостью к вирусам. Особенно чувствительны к вирусам животные-гнотобионты. Работу животными рекомендуется проводить в настольном боксе или в специальной операционной вивария. Все отходы и трупы погибших животных автоклавируют и сжигают. При вирусологических исследованиях применяют подкожное, накожное, внутрикожное, внутримышечное, внутрибрюшинное, внутривенное, пероральное, интраназальное, интрацеребральное заражение лабораторных животных. Метод используют для выделения пневмотропных вирусов. Заражение мышей проводится под эфирным наркозом. Животных помещают в закрытую стеклянную банку, в которую положен кусок ваты, пропитанный эфиром. С помощью шприца или пастеровской пипетки в ноздри животного вводят 0,,1 мл заражающего материала. За животными устанавливается наблюдение, при проявлении признаков заболевания мышей забивают при помощи эфирного наркоза, а затем вскрывают. Ножницами делают продольный разрез кожи от нижней челюсти до лобка и боковые разрезы к лапкам, отсепаровывают её. Осматривают внешний вид органов грудной полости, обращая внимание на наличие экссудата. Извлекают лёгкие при строгом соблюдении асептики и сохраняют их при минусовой температуре в морозильнике до получения ответа на бактериологический контроль-результат посева кусочка легочной ткани в мясо-пептонный бульон после выдерживания его в термостате при С в течение суток. Метод предназначен для выделения нейротропных вирусов. При заражении мыши в мозг её плотно прижимают левой рукой к столу, большим и указательным пальцами оттягивают кожу головы к затылку, мизинцем и безымянным фиксируют хвост. Заражающий материал кровь в объёме 0,,03 мл вводят в мозг туберкулиновым шприцем с тонкой иглой путём прокола лобной кости на глубину 1, мм. Обрабатывают кожные покровы головы последовательно спиртом, йодом и вновь спиртом, опаливают пламенем. Вскрывают и отделяют кожу головы. Отрезают голову, помещают её в стерильную чашку Петри, проведя предварительно через пламя горелки. Вскрывают ножницами черепную коробку, извлекают мозг и сохраняют его в замороженном состоянии до получения результата бактериологического контроля. Освобождают её от крупных тканевых частиц центрифугированием, надосадочную жидкость используют для вирусологической работы. На лабораторных животных проводят титрование вирусов, ставят реакцию нейтрализации; животных используют для получения вирусных вакцин , диагностикумов, противовирусных сывороток. Назовите и охарактеризуйте методы электронной микроскопии, применяемые при изучении вирусов. Солевые растворы и питательные среды, используемые для культивирования культур клеток. Строение развивающегося куриного эмбриона КЭ и подготовка инкубированных КЭ к заражению. Биргер по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. Голубев по применению клеточных культур в вирусологии. При заражении вирусами клеточных культур можно получать различные видимые проявления действия вируса:. Окончательная идентификация выделенного вируса проводится с помощью реакции нейтрализации с диагностическими вируснейтрализующими сыворотками. Определяют их родовую и видовую принадлежность. Основной причиной ЦПД является нарушение метаболизма клетки. Прекращается синтез РНК клетки-хозяина, что ведёт к подавлению синтеза белков, приводит к нарушению структуры клеточных мембран, лизосом, митохондрий. Освобождаются и активируются клеточные ферменты лизосомальные , которые вызывают деструкцию клеточных компонентов, т. При резкой дегенерации клеточный монослой гибнет. При острой вирусной инфекции может наблюдаться образование гигантских многоядерных клеток — симпластов или синцитиев. Симпластообразование вызывают более 20 различных вирусов, имеющих ферменты: К проявлению ЦПД вирусов относится образование внутриклеточных включений. Они образуются, если вирус не вызывает гибели клеток, или на стадиях до наступления гибели. Образование включений может быть единственным проявлением реакции клетки на внедрение вируса. С целью обнаружения вируса в материалах от больных проводят заражение исследуемым материалом однослойных культур клеток. Для заражения отбирают пробирки со сплошным клеточным слоем, просматривая их под малым увеличением микроскопа. Перед заражением из пробирок отсасывают культуральную жидкость, затем вносят по 0,1 мл исследуемого материала и добавляют питательную среду до 1 мл. Каждую пробу материала вносят в 4 пробирки. Для контроля несколько пробирок оставляют незаражёнными, но также сменяют в них питательную среду. Пробирки выдерживают в термостате, обычно при С, и ежедневно микроскопируют с целью обнаружения ЦПД в течение недели и более. ЦПД различных вирусов на клеточные культуры обладает определённой специфичностью. Родственные вирусы дают цитопатическую реакцию сходного типа, эффект действия отдалённых по свойствам вирусов часто различен, поэтому по типу ЦПД можно судить о семействе или роде, к которым относится исследуемый вирус:. Количественное определение вирусов в исследуемом материале проводится с помощью титрования. Для этой цели готовят кратные последовательные разведения вируса, которыми заражают клеточные культуры. Титром вируса называют его наибольшее разведение, вызывающее ЦПД в половине заражённых культур. Титр вируса выражают в цитопатических дозах ЦПД50 в 1 мл. За одну ЦПД50 принимают 0,1 мл вируссодержащего материала, разведённого до титра. Для идентификации выделенного вируса по нейтрализации ЦПД культуральную жидкость смешивают с равным объёмом диагностической иммунной сыворотки разведение сыворотки 1: После часового контакта при комнатной температуре этой смесью по 0,2 мл заражают 4 пробирки с культурой клеток, из которой предварительно была удалена питательная среда; после добавления смеси в пробирки вносят по 0,8 мл свежей среды. Опыт сопровождается несколькими контролями:. Опыт учитывают через дней и более, просматривая пробирки под малым увеличением микроскопа. В первом контроле ЦПД должно отсутствовать, во втором и третьем — обязательное проявление ЦПД. Отсутствие цитопатического эффекта в опытных пробирках указывает, что в данной пробе произошла нейтрализация вируса иммунной сывороткой, сыворотка соответствует типу выделенного вируса. Гемадсорбирующие свойства имеют многие вирусы: Эти же вирусы обладают спосодностью вызывать гемагглютинацию — склеивание эритроцитов. Приобретение способности к гемадсорбции связано со встраиванием в мембрану заражённых вирусом клеток вирусспецифических белков — гемагглютининов, к которым эритроциты имеют комплементарные рецепторы и поэтому адсорбируются на поверхности заражённых клеток. В реакции применяют эритроциты морской свинки, кур, обезьян, человека 0 I группы. По наличию явления гемадсорбции обнаруживают присутствие вирусов в культурах клеток при латентной инфекции, когда цитопатический эффект оказывается слабо выраженным или отсутствует совершенно. Предварительно клеточные культуры заражают исследуемым материалом. Реакцию гемадсорбции ставят каждые два дня до появления положительной реакции в течение дней. Температура, при которой ставят опыт, и экспозиция зависит от вида вируса. Пробирки встряхивают и оставляют на некоторое время в вертикальном положении для оседания неадсорбировавшихся эритроцитов. При микроскопии под малом увеличением в опытной пробирке регистрируют положительную реакцию гемадсорбции, выражающуюся в том, что эритроциты адсорбируются на клетках культуры, прилипая к клеточному слою; в контрольной пробирке клеточный слой свободен от эритроцитов. При добавлении специфической иммунной сыворотки в пробирку с клеточной культурой, предварительно заражённой соответствующим вирусом, заражённые клетки теряют способность адсорбировать эритроциты, т. Вследствие специфичности этого явления реакция задержки гемадсорбции может быть использована для идентификации выделенных вирусов, а также с целью обнаружения и титрования вируснейтрализующих антител в сыворотках больных. Для получения бляшек клеточный монослой заражают небольшой концентрацией вируса и фиксируют адсорбировавшиеся на клетках вирионы с помощью агарового покрытия, в которое добавлен витальный краситель — нейтральный красный. ЦПД вирусов имеет очаговый характер, погибшие клетки дегенерируют, теряют способность удерживать нейтральный красный и обесцвечиваются. В результате на непрозрачном равномерно розовом фоне клеточного монослоя появляются бляшки в виде более прозрачных неокрашенных округлых пятен. Раствор нейтрального красного входит в состав среды или его добавляют во флакон или чашку незадолго до учёта опыта. Флаконы закрывают резиновыми пробками, чашки заклеивают лейкопластырем и помещают в термостат на дней для получения монослоя клеток, который должен быть сплошным, без признаков дегенерации. Перед заражением среду из флаконов или чашек удаляют и однослойную культуру клеток осторожно отмывают раствором Хенкса, который затем тщательно отсасывают. Заражение производят путём внесения разведённого исследуемого материала в объёме 0,,25 мл и равномерного распределения этого материала по поверхности клеточного слоя с помощью покачивания. Через минут заражённую культуру клеток заливают покровной средой. Флаконы или чашеи с застывшей средой помещают в термостат клеточным слоем кверху и выдерживают до образования бляшек суток , после чего производят их подсчёт и изучение. Разные вирусы образуют бляшки, отличающиеся по величине, форме, характеру краёв, по срокам появления и другим свойствам, что может быть использовано для предварительной идентификации вируса. Для титрования вирусов готовят серийные разведения вируссодержащего материала и каждое из разведений вносят во флакон или чашку со слоем культуры клеток. Подсчитав образовавшиеся бляшки с учётом разведения вируса , вычисляют титр вируса — количество вирионов в 1,0 мл исходного материала. Титр вируса, определяемый методом бляшек, принято выражать числом бляшкообразующих единиц БОЕ в 1 мл. Метод бляшек даёт возможность провести точную идентификацию вируса с помощью диагностических специфических сывороток. При соответствии между сывороткой и вирусом происходит нейтрализация вируса и при заражении монослоя клеток такой смесью бляшки не образуются или их количество значительно снижается. Цветная проба или цветная реакция основана на разнице в цвете среды индикатором фенолрот, в которой растёт нормальная, жизнеспособная культура клеток, и среды, где находится культура, заражённая вирусом. В процессе развития нормальной культуры клеток происходит постепенное накопление кислых продуктов обмена веществ, что приводит к сдвигу рН в кислую сторону. Такое изменение реакции среды говорит о наличии роста и размножения клеток. Среда с индикатором фенолрот, первоначально имевшая красный цвет рН 7,4 — 7,6 , вследствие снижения рН до 7,0 — 6,8 приобретает жёлтый цвет. Заражение культуры клеток вирусом приводит к развитию в ней дегенеративных процессов: С помощью цветной реакции можно определить соответствие вируса и вируснейтрализующей сыворотки, если их предварительно смешать и эту смесь после инкубации внести в культуру клеток. Специфическая сыворотка нейтрализует вирус и он не оказывает цитопатическое действие на клетки культуры. Цветную пробу ставят с различными типами клеточных культур. Чаще берут первичную культуру клеток почки обезьяны или перевиваемые культуры клеток. При постановке цветной реакции необходимо учитывать, что каждая культура клеток, на которой ставят реакцию, имеет определённый уровень метаболизма. Устанавливают дозу клеток для цветной реакции, то есть то оптимальное количество клеток, которое должно быть взято в каждую пробирку. При работе с культурой почечных клеток обезьяны готовят взвесь клеток густотой тыс. Из неё делают ряд возрастающих разведений в объёме 0,25 мл и определяют минимальное количество клеток, которое при постановке цветной пробы изменяет цвет питательной среды из красного в жёлтый н й день выдерживания в термостате; это количество и принимается за дозу клеток. Обычно эта доза — 25 тыс. Цветную пробу ставят в пробирках, которые иногда закрывают резиновыми пробками, но чаще разобщение от атмосферного воздуха достигается наслаиванием стерильного вазелинового масла 0,,8 мл или применение алюминиевой фольги. Однотипную опытную смесь наливают в четыре пробирки. При титровании вируса по цветной пробе готовят десятикратные разведения вируссодержащего материала. Эти разведения вируса, взятые в объёме 0,25 мл, смешивают с 1 дозой клеток, содержащейся в таком же объёме, добавляют питательную среду по 0,25 мл и наслаивают вазелиновое масло по 0,,8 мл. В реакции ставят контроли клеточной взвеси: Пробирки помещают на дней в термостат при С после чего по изменению цвета учитывают реакцию. В данном примере табл. Количество вируса, содержащееся в объёме 0,25 мл в разведении, равном титру, называется цитопатической дозой ЦПД50 вируса. Применение реакции гемагглютинации РГА , реакции торможения гемагглютинации РТГА и биологических моделей для индикации и идентификации вирусов. Методы культивирования, индикации и идентификации вирусов. Методические рекомендации Методички Предприятия Методы Восток Вирусы. Заражение куриных эмбрионов 1. Заражение в аллантоиную полость Для заражения берут эмбрионы дневного возраста. В центре тупого конца делают прокол скорлупы с помощью препаровальной иглы. Отверстие в скорлупе заделывают с помощью расплавленного стерильного парафина. Вскрытие производится в следующем порядке: С помощью ножниц скорлупу срезают немного выше границы воздушного пространства. Заражение в полость амниона Для заражения используют эмбрионы дневного возраста. Техника открытого метода заражения: Яйцо помещают на подставку и проводят стерилизацию скорлупы в области тупого конца. Техника вскрытия эмбриона при заражении в амниотическую полость: Культивирование вирусов путём заражения лабораторных животных Восприимчивые к изучаемым вирусам животные называются экспериментальной моделью. Лабораторное животное При вирусологических исследованиях применяют подкожное, накожное, внутрикожное, внутримышечное, внутрибрюшинное, внутривенное, пероральное, интраназальное, интрацеребральное заражение лабораторных животных. Интраназальное заражение Метод используют для выделения пневмотропных вирусов. Подписаться на рассылку Pandia. Интересные новости Важные темы Обзоры сервисов Pandia. Основные порталы, построенные редакторами. Бизнес и финансы Бизнес: Каталог авторов частные аккаунты. Все права защищены Мнение редакции может не совпадать с мнениями авторов. Минимальная ширина экрана монитора для комфортного просмотра сайта: Мы признательны за найденные неточности в материалах, опечатки, некорректное отображение элементов на странице - отправляйте на support pandia. Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах: Вирус бешенства Вирус Коксаки Вирус полиомиелита Вирус гриппа Вирус клещевого энцефалита. Мыши, кролики Мыши-сосунки Обезьяны, крысы Мыши, хорьки Мыши. Ингредиенты опыта в мл. Взвесь клеток 1 доза. Цвет среды в пробирках красный или жёлтый. К-4 — красного цвета 4 пробирки; Ж-3 — жёлтого цвета 3 пробирки. О проекте Справка О проекте Сообщить о нарушении Форма обратной связи. Авторам Открыть сайт Войти Пожаловаться. Архивы Все категории Архивные категории Все статьи Фотоархивы. Лента обновлений Педагогические программы. Правила пользования Сайтом Правила публикации материалов Политика конфиденциальности и обработки персональных данных При перепечатке материалов ссылка на pandia.
https://gist.github.com/88bb4d413ee52bcdbd5e41f1cab2c4bc
https://gist.github.com/df73f57d733f990366d401ec7f685000
https://gist.github.com/85e62126538dd1a4418610756321e7af