ЦИТОХРОМЫ это:
/ Цитохромы Р450. Структура и функция
Строение и характеристика цитохромов и железосерных белков
Работа выполнена в Государственном учебно-научном учреждении Факультет фундаментальной медицины Московского государственного университета имени М. Красновский Александр Александрович - доктор биологических наук, профессор, ФГБУН Институт биохимии им. Баха РАН, заведующий лабораторией биохимии синглетного кислорода. Добрецов Геннадий Евгеньевич — доктор физико-математических наук, профессор, член-корреспондент РАМН, ФГБУН НИИ ФХМ ФМБА России, заведующий лабораторией биофизических методов диагностики. Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической физики им. Программируемая смерть клеток апоптоз играет важную роль в морфогенезе и в развитии патологических состояний. Центральным событием в развитии апоптоза, как правило, является выход цитохрома с из митохондрий с последующим запуском каскада апоптотических реакций в клетке. К сожалению, как структура комплекса цитохрома с с кардиолипином, так и механизм его пероксидазного действия па органические молекулы, в том числе на липиды, пока мало изучены. В данной работе проведено исследование структуры и состава комплекса цитохрома с с кардиолипином, изучена пероксидазная функция этого комплекса в разных условиях. Показано, что этот комплекс обладает способностью разлагать липогидропероксиды с образованием пероксильных радикалов и липопероксидазным действием. Исследовано влияние антиоксидантов на реакции, катализируемые комплексом Цит-КЛ. Полученные результаты помогут в будущем разработать методы управления апоптозом, что имеет большое значение для лечения ряда важнейших патологий. Целью данной работы было изучение структуры и состава комплекса Цит-КЛ, полученного в разных условиях, а также его пероксидазной и липопероксидазной функции на основе критического пересмотра литературных данных и разработки новых аналитических методик. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:. Исследовать взаимодействие цитохрома с и его комплекса с кардиолипином с жирными кислотами, а так же влияние пероксида водорода на данное взаимодействие. Исследовать влияние антиоксидантов на пероксидазную активность комплекса Цит-КЛ и на взаимодействие цитохрома с и его комплекса с кардиолипином с жирными кислотами. В данной работе было показано, что цитохром с образует с кардиолипином комплексы определенного состава, плохо растворимые в воде. Было определено молярное соотношение КЛ: Цит в комплексах, полученных при различных значениях рН, и показано, что могут формироваться два устойчивых комплекса, один в нейтральной, в другой - в кислой среде при рН меньше 5,5. Показана возможность перехода этого комплекса в гидрофобную среду и определен состав комплекса в гидрофобной среде. Впервые была изучена структура осадка комплекса Цит-КЛ при различных рН среды методами малоуглового рентгеновского рассеяния. Полученные данные подтвердили вывод о существовании двух типов комплексов, имеющих разное соотношение КЛ: Цит и соответственно разный диаметр наносфер, которые в водном растворе образуют микрокристаллы с различными расстояниями между отражающими плоскостями. Определена пероксидазная активность комплекса Цит-КЛ при различных рН среды. Впервые методом активированной хемилюминесценции показана способность комплекса цитохрома с с липидами разлагать липогидропероксиды с образованием свободных липопероксильных радикалов. Показана способность комплекса окислять жирную кислоту пероксидом водорода с образованием липопероксильного радикала липопероксидазная функция комплекса. Основным результатом работы является углубление фундаментальных знаний о начальной стадии программируемой смерти клетки. Данные о структуре комплекса цитохрома с с кардиолипином и механизме реакций, которые он катализирует, имеют решающее значение для контроля апоптоза с целью профилактики и лечения болезней человека. Автором были разработаны или усовершенствованы ряд аналитических хемилгаминесцентных методик для определения антиоксидантной активности, пероксидазной активности и количества липидных гидропероксидов в системе. Все эти методы могут найти применение в лабораторной практике. Полученные данные могут быть использованы при преподавании курсов медицинской биофизики в медицинских вузах и университетах. Положения, выносимые на защиту. Комплекс Цит-КЛ представляет собой соединение определенного состава, малорастворимое в воде и хорошо растворимое в гидрофобной среде, причем состав комплекса и структура осадка зависит от рН среды. Механизм пероксидазного действия Цит-КЛ аналогичен механизму действия других пероксидаз; пероксидазная активность комплекса на два порядка величины меньше активности пероксидазы из корней хрена. Пероксидазной функцией также обладает комплекс цитохрома с с линолевой кислотой. Комплексы цитохрома с с кардиолипином или с линолевой кислотой катализируют реакцию разложения липидных гидропероксидов, при этом образуются свободные радикалы и вторичные продукты перекисного окисления. Было показано образование пероксильных радикалов при окислении липидов пероксидом водорода, катализируемое комплексом цитохрома с; таким образом, комплекс цитохрома с с липидами обладает липопероксидазной активностью. Антиоксиданты действуют на пероксидазную функцию Цит-КЛ путем взаимодействия с продуктом реакции свободных радикалов со вторым субстратом люминолом. Антиоксиданты также действуют на реакции образования липопероксильных радикалов при разложении липидных гидропероксидов. Разработанные хемилюминесцентные методики определения антиоксидантной активности, пероксидазной активности и определения липидных гидропероксидов в водной среде являются частью практического курса кафедры медицинской биофизики факультета фундаментальной медицины Московского государственного университета имени М. Полученные данные о структуре и свойствах комплекса Цит-КЛ являются составной частью лекционных курсов указанной кафедры. По теме диссертации опубликовано 6 печатных научных работ, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ. Все данные в диссертации, были получены лично автором; в немногих случаях, когда в работе участвовали также и другие сотрудники, это специально оговорено в тексте диссертации. С этой целью автор освоил все используемые в работе методы. Лично автором проведена также и обработка и статистический анализ результатов. Основные результаты диссертации были представлены в устных докладах, а также тезисах трех конференций, среди которых: Диссертационная работа апробирована 17 сентября г. Ломоносова и кафедры общей и медицинской биофизики ГБОУ ВПО РНИМУ им. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 4 главы результатов и обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы, включающего источника. Работа выполнена на страницах машинописного текста. Иллюстрированный материал представлен 88 рисунками и 5 таблицами. В работе использовали трис-HCl, КН2РО4, КОН, Na2S03, калия гидрофталат, Н, хлороформ, н-гексан, метанол, FeS04 все не ниже х. Спектры поглощения регистрировали при помощи спектрофотометра SPECORD "Analytic Jena", Германия. Измерения проводили в стеклянных и пластиковых кюветах с длиной оптического пути 1,00 см. Для измерения хемилюминесценции XJI использовали хемилюминометр SmartLum "ИнтерОптика-С", Россия. Для изучения механизма хемилюминесцентных реакций использовали подход, основанный на математическом моделировании кинетики хемилюминесцентной кривой. Математическое моделирование производили при помощи программы "Kinetic Analyser" автор Д. Измайлов путем построения теоретических кинетических кривых при заданных константах скоростей и начальных концентрациях и сопоставления с экспериментальными зависимостями. Погрешность S рассчитывали по формуле: Относительное стандартное отклонение sr рассчитывали по формуле: Предел обнаружения cmin рассчитывали по формуле: За коэффициент чувствительности к принимали коэффициент наклона градуировочной прямой. Линеаризацию данных проводили с использованием метода наименьших квадратов. К известному количеству цитохрома с добавляли известные разные количества кардиолипина, при этом кардиолипин связывался с белком с образованием осадка. После добавления кардолипина раствор центрифугировали, супернатант отделяли от осадка и измеряли спектр поглощения в диапазоне нм, в котором поглощает цитохром с или его комплекс полоса Соре нм. Концентрация цитохрома с в растворе линейно. В точке А рис. Определение состава комплекса Цит-КЛ методом спектрофотометрического титрования при рН 7,4. Добавление 1 мМ кардиолипина каждый раз связывает 17 мкМ цитохрома с с образованием осадка. Экстраполяция полученной зависимости на ось абсцисс дает количество кардиолипина, полностью связывающего цитохром с и позволяет рассчитать стехиометрическое соотношение в осадке. В точке А добавление КЛ не приводит к дальнейшему образованию осадка, поглощение, по всей вероятности, обусловлено растворимой формой комплекса. Предполагаемая схема образования комплекса без учета протонов: Существование в водной фазе комплекса подтверждено наличием у раствора над осадком пероксидазной активности, характерной для комплекса Цит-КЛ, но не для цитохрома с. При различных значениях рН установлен стехиометрический состав комплекса и рассчитаны значения растворимости табл. Растворимость 5 и состав комплекса Цит-КЛ, подученного при различных значенияхрН в водной среде. Эта величина согласуется с вышеизложенной гипотезой о строении комплекса и подтверждается простейшими расчетами. Глобула этого белка имеет форму эллипсоида с соотношением осей 4,0 X 3,5 X 3,0 нм, площадь поверхности составляет примерно 40 нм2. Данные о размерах фосфолипидной головки кардиолипина варьируют, но поперечное сечение трех жирнокислотных цепей четвертая погружена вглубь цитохрома составляет примерно 0,6 нм2. Таким образом, на поверхности белка при плотной упаковке могут расположиться до 65 молекул кардиолипина. При понижении рН среды от 7,4 до 5,5 соотношение КЛ: Методом спектрофотометрии показано, что цитохром с при взаимодействии с кардиолипином экстрагируется в гидрофобную среду в виде комплекса определенного состава. Готовили смеси цитохрома с с кардиолипином различного состава и экстрагировали в смесь. При увеличении соотношения КЛ: Цит оптическая плотность гидрофобной фазы линейно увеличивалась рис. По тангенсу угла наклона прямой на рис. Таким образом, экстрагируется именно комплекс цитохрома с с кардиолипином. Полученные данные также свидетельствуют в пользу гидрофобности комплекса, в молекуле которого жирнокислотные хвосты кардиолипина направлены наружу, а гидрофильные головки внутрь. Цитохром с в присутствии кардиолипина образует нерастворимый в одной среде комплекс. Полученные результаты позволяют предположить пространственное строение комплекса. При высоком содержании липида в комплексе рН 7,4 , липидные молекулы ориентированы перпендикулярно поверхности белка рис. Эта гипотеза подтверждается расчетами. Если принять диаметр молекулы. Зависимость концентрации перешедшего в гидрофобную среду цитохрома с от концентрации КЛ. При снижении числа молекул липида, окружающих белок, что происходит при кислых рН, липидные молекулы находятся под некоторым углом к поверхности белка, таким образом, размер частицы комплекса Цит-КЛ уменьшается рис. Предполагаемое строение комплекса Цит-КЛ при нейтральных А Владимиров с сотр. Частица комплекса состоит из белкового ядра и липидной оболочки. При нейтральных рН реализуется плотная упаковка липидных молекул, а липидные хвосты ориентированы перпендикулярно поверхности; при низких рН молекулы липида координированы неплотно, и хвосты располагаются под углом к поверхности, при этом диаметр частицы комплекса уменьшается. Исследование иероксидазной функции комплекса Цит-КЛ Для исследования пероксидазной функции изучена активность комплекса в присутствии органического субстрата люминол при различных условиях протекания реакций. Исследовалось влияние рН на интенсивность хемилюминесценции при окислении люминола в системе с Цит-КЛ при различных соотношениях. При повышении ионной силы пероксидазная активность незначительно возрастает. При постоянных значениях рН увеличение соотношения КЛ: Цит приводило к возрастанию пероксидазной активности. Во всех 20 мМ фосфатный буферный раствор. Было изучено влияние количества добавляемого пероксида водорода на интенсивность хемилюминесценции. В отсутствие Н хемилюминесценция не наблюдается. Добавление Н в систему приводит к появлению хемилюминесценции, пропорциональной количеству введенного Н, при этом сама форма кривых хемилюминесценции почти не изменяется, Аналогичные кривые были получены для пероксидазы из корней хрена. Зависимость максимальной интенсивности амплитуды хемилюминесценции от концентрации Н была линейной при малых концентрациях, причем эта зависимость имеет такой же наклон, как и в системе с пероксидазой из корней хрена. Влияние концентрации люминола на интенсивность хемилюминесценции может быть описано кривой с насыщением. Полученные результаты позволяют предположить, что механизм окисления органического субстрата комплексом Цит-КЛ в целом соответствует механизму действия известных пероксидаз. По аналогии с известными реакциями пероксидаз и на основании экспериментальных данных была предложена следующая схема схема 2 реакций окисления люминола в системе Цит-КЛ:. А- Экспериментальная кинетика хемилюминесценции системы, состоящей из 10 мкМ Н2О2, 80 мкМлюминола и различных концентраций комплекса Цит-КЛ - 1, 2. В процессе работы моделировали возможные схемы реакций, в том числе схему 2. В целом, эта схема реакций подтвердилась, поскольку опа позволила смоделировать экспериментальную кинетику хемилюминесценции, наблюдаемую при различных условиях. Однако точный подбор всех пяти констант скоростей реакции оказался практически невозможным из-за того, что кинетика зависит от наиболее медленных звеньев в цепи последовательных реакций, а изменение скорости быстрых звеньев в широких пределах на кинетику процесса в целом влияния практически не оказывает. В этом смысле предложенная схема 2 в двух отношениях является избыточной. Реакции 3 и 4 протекают последовательно и приводят к восстановлению исходного комплекса Цит-КЛ и образованию электронно-возбужденного продукта люминола, поэтому они могут быть описаны одной общей реакцией. Таким образом, можно упростить схему 2 до трех реакций схема 3. В этом случае константы скоростей всех трех реакций удалось подобрать с достаточной точностью. Расчеты, проведенные с использованием данной схемы и приведенных констант скоростей дают кривые, весьма сходные с экспериментальными Рис. Нами было проведено сравнение пероксидазной активности комплекса Цит-КЛ по отношению к ПХ и оказалось, что при молярном соотношении КЛ: Влияние антиоксидантов на пероксидазиую активность комплекса Цит-КЛ изучали с помощью разработанной хемшпоминесцентной методики. В качестве модельных антиоксидантов использовали тролокс водорастворимый аналог витамина Е , аскорбат натрия и кверцетин. Во всех трех указанных системах каждый из антиоксидантов действовал примерно в одних и тех же концентрациях, а хемилюминесцентные кривые имели схожую кинетику. Можно предположить, что мишенью действия изученных антиоксидантов являются не первичные свободные радикалы, образующиеся при разложении АБАП или взаимодействии Н с гемопротеидом разные в этих случаях , а продукт их взаимодействия с люминолом, вероятно, радикал люминола, который везде один и тот же. Видно, что формы кривых близки при всех исследованных концентрациях антиоксиданта -тролокса. Кинетические кривые, рассчитанные при помощи математического моделирования и экспериментальные данные с антиоксидантом - тролоксом. АБАП - 3 мМ, люминол мкМ, концентрации тролокса мкМ указаны на рисунке. В этих исследованиях в качестве липидного субстрата использовали линолевую кислоту. Было показано, что при взаимодействии цитохрома с линолевой кислотой образуется осадок, как и в случае с кардиолипином. В расчете на одинаковое количество цитохрома с этот осадок обладал пероксидазной активностью, даже большей, чем комплекс Цит-KJI. Таким образом, в наших опытах с линолевой кислотой последняя играла роль не. В качестве активатора хемилюминесценции во всех экспериментах использовали кумарин С, селективно усиливающий свечение при взаимодействии липипероксильных радикалов LOO". При добавлении как цитохрома с, так и комплекса Цит-КЛ к полиненасыщенной жирной кислоте обозначим как LH , содержащей некоторое количество гидропероксидов LOOH , наблюдалась вспышка хемилюминесценции, свидетельствующая о появлении радикалов LOO" в системе. Было показано, что амплитуда и светосумма вспышки хемилюминесценции определяются количеством LOOH в системе. Мы готовили растворы линолевой кислоты с разным количеством гидропероксидов путем продувания воздуха через раствор в течение разного времени. Было показано, что светосумма вспышки хемилюминесценции прямо пропорциональна количеству LOOH в системе рис. Было показано, что после взаимодействия цитохромом с липидные гидропероксиды в линолевой кислоте почти полностью исчезают. Оптические спектры поглощения линолевой кислоты в гептане после ее взаимодействия с цитохромом с и с Цит-КЛ свидетельствуют об образовании триеновых конъюгатов поглощение при нм и вторичных. Спектры поглощения в УФ области: На рисунке вертикальными линиями обозначены основные полосы поглощения с указанием их длин волн. На основании полученных результатов и литературных данных Владимиров с сотр. В результате разложения LOOH происходит разрушение гемопротеина через стадию его окисления СО и образование пероксил-радикалов LOO", часть из которых атакует липогидропероксиды с образованием вторичных продуктов окисления липидов. В следующей серии экспериментов было показано увеличение количества липопероксильных радикалов светосуммы хемилюминеценции при введении пероксида водорода в систему, содержащую линолевую кислоту, цитохром с и кумарин С При этом концентрация пероксида водорода была в 6,5 раз меньше, чем содержание липидных гидропероксидов в линолевой кислоте, хотя в присутствии Н светосумма ХЛ увеличивалась вдвое. Данный факт говорит о том, что Цит-JIK проявляет липопероксндазную активность, а образование дополнительных липопероксильных радикалов можно объяснить, предположив схему реакций Таким образом, одна молекула пероксида водорода порождает два липидных алкил-радикала реакции 3 и 4 и, следовательно, два липопероксильных радикала в реакции 5. При этом антиоксидантное действие тролокс оказывал при концентрациях мкМ, что на два порядка больше концентраций, оказывающих действие на пероксидазную активность комплекса Цит-КЛ, измеренную по хемилюминесценции в присутствии люминола. Предположительно, молекулы комплекса состоят из белка, окруженного липидной оболочкой, причем гидрофильные головки липида направлены в сторону белка, а гидрофобные цепи нарузку. При нейтральных рН реализуется плотная упаковка липидных молекул, а липидные хвосты ориентированы перпендикулярно поверхности; при низких рН молекулы липида координированы неплотно, и хвосты располагаются под углом к поверхности, при этом размер частицы комплекса уменьшается. Комплекс Цит-КЛ может быть переведен в гидрофобную фазу, причем стехиометрический состав комплекса аналогичен составу комплекса в осадке. Механизм пероксидазного действия Цит-КЛ аналогичен механизму действия других известных пероксидаз, но активность Цит-КЛ в раз меньше, чем активность пероксидазы хрена. В результате разложения LOOH происходит разрушение гемопротеина через стадию его окисления и образование пероксил-радикалов LOO", часть из которых атакует липогидропероксиды с образованием вторичных продуктов окисления липидов. В окислении полиненасыщенных жирных кислот, катализируемых комплексом Цит-ЛК, участвует пероксид водорода, таким образом, комплекс цитохрома с с липидами обладает липопероксидазной активностью. Антиоксиданты действуют также и на реакции окисления липидов, катализируемые Цит-ЛК, причем антиоксидантное действие проявляется при концентрациях, на два порядка больших, чем при действии тех же антиоксидантов на пероксидазную активность Цит-КЛ по отношению к люминолу. Хемилюминесцентные методы клинической лабораторной диагностики. Материалы конференции, Москва, Хемилюминесцентное определение антиоксидантов и гидроперекисей липидов. Определение пероксидаз в биологических системах хемилюминесцентным методом. Цитохром с как катализатор реакций перекисного окисления липидов 44 3. Материалы и методы Список сокращений Принятые сокращения: В году была впервые описана одна из форм гибели клеток - апоптоз [1]. Апоптоз играет важную роль в морфогенезе и в развитии патологических состояний. Выход цитохрома с Цит становится возможным благодаря повреждению внутренней мембраны в результате перекисного окисления липидов [2], при этом пусковым механизмом служит превращение цитохрома в пероксидазу при его взаимодействии с кардиолипином КЛ. К сожалению, как структура комплекса цитохрома с с кардиолипином, так и механизм его пероксидазного действия на органические молекулы, в том числе на липиды, пока мало изучены. Изучено влияние водорастворимых антиоксидантов на пероксидазную активность комплекса цитохрома с с кардиолипином и на образование липопероксильных радикалов при разложении гидропероксидов липидов комплексом цитохрома с с линолевой кислотой Цит-ЛК. Автором были разработаны или усовершенствованы ряд аналитических хемилюминесцентных методик для определения антиоксидантной активности, пероксидазной активности и количества липидных гидропероксидов в системе. Механизм пероксидазного действия Цит-КЛ аналогичен механизму действия других пероксидаз; пероксидазная активность комплекса надва порядка величины меньше активности пероксидазы из корней хрена. Цитохром с - водорастворимый белок небольших размеров молекулярная масса около 12 кДА , состоящий из белковой части и гемма с. Гем ковалентно связан с апобелком через БН-группы с Суз и Суз рис. Это отличает цитохромы типа с от цитохромов а- и Ъ- типов, где гемы связаны нековалентно. Цит в основном находится на внешней стороне внутренней мембраны митохондрии. Формирование цитохрома с происходит в цитоплазме в виде неактивного апофермента, далее он транспортируется в межмембранное митохондриальное пространство, затем происходи присоединение тема [6]. Центральный атом железа в геме способен к обратимому одноэлектронному взаимодействию: У позвоночных в состав Цит входит аминокислотных остатка, насекомых - , низших растений , высших растений - в одном случае Последовательности остатков отражают биологическую эволюцию: Сравнивая число аминокислотных замен в Цит некоторых видов по сравнению с Цит человека табл. Цитохром с - консервативный белок, однако чем дальше филогенетически расположены организмы, тем больше различий в структуре этого белка. Группа гема соединена пятой и шестой координационными связями атома железа с имидазольным кольцом Гис и атомом серы Мет, что также отличает цитохромы от гемоглобина, в которой координационная связь. Структура Цит характеризуется расположением гидрофобных остатков внутри молекулы, тогда как заряженные расположены на ее поверхности. Структуры окисленной и восстановленной форм Цит практически не отличаются []. Функция цитохрома с в организме. Одной из важных функций Цит в живом организме является его участие в клеточном дыхании. Компоненты дыхательной цепи встроены в митохондриальную мембрану в виде 4 белково-липидных комплексов: Перенос электронов между комплексами осуществляется за счет диффузии относительно небольших молекул: Активный центр цитохрома с, имея шесть коордиоционных связей, дает способность к переносу электронов. Помимо вышеописанной функции, окисленная форма цитохрома с способна окислять супероксидный радикал с образованием молекулярного кислорода [13]:. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУН НИИ ФХМ ФМБА России. Цель и задачи исследования Целью данной работы было изучение структуры и состава комплекса Цит-КЛ, полученного в разных условиях, а также его пероксидазной и липопероксидазной функции на основе критического пересмотра литературных данных и разработки новых аналитических методик. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи: Определить состав и структуру комплекса цитохрома с с кардиолипином. Изучить пероксидазную функцию комплекса цитохрома с с кардиолипином и жирными кислотами. Научная новизна исследования В данной работе было показано, что цитохром с образует с кардиолипином комплексы определенного состава, плохо растворимые в воде. Изучено влияние водорастворимых антиоксидантов на пероксидазную активность комплекса цитохрома с с кардиолипином и на образование 4 липопероксильных радикалов при разложении гидропероксидов липидов комплексом цитохрома с с линолевой кислотой Цит-ЛК. Практическое значение работы Основным результатом работы является углубление фундаментальных знаний о начальной стадии программируемой смерти клетки. Положения, выносимые на защиту 1. Внедрение результатов Разработанные хемилюминесцентные методики определения антиоксидантной активности, пероксидазной активности и определения липидных гидропероксидов в водной среде являются частью практического курса кафедры медицинской биофизики факультета фундаментальной медицины Московского государственного университета имени М. Публикации По теме диссертации опубликовано 6 печатных научных работ, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ. Личное участие автора Все данные в диссертации, были получены лично автором; в немногих случаях, когда в работе участвовали также и другие сотрудники, это специально оговорено в тексте диссертации. Апробация работы Основные результаты диссертации были представлены в устных докладах, а также тезисах трех конференций, среди которых: Структура и объем работы Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 4 главы результатов и обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы, включающего источника. Математическое моделирование Для изучения механизма хемилюминесцентных реакций использовали подход, основанный на математическом моделировании кинетики хемилюминесцентной кривой. Исследование структуры комплекса Цит-КЛ Определение состава осадка комплекса Цит-КЛ и его растворимости К известному количеству цитохрома с добавляли известные разные количества кардиолипина, при этом кардиолипин связывался с белком с образованием осадка. Концентрация цитохрома с в растворе линейно уменьшалась в зависимости от количества добавленного кардиолипина до момента, когда осадок переставал образовываться, а дальнейшее добавление кардиолипина приводило к увеличению экстинкции за счет светорассеяния рис. Буферный раствор КН2Р04 20 мМ КН2Р04 20 мМ КН2Р04 20 мМ 1Ш2Р04 20 мМ Фталатный 50 мМ рн 7,4 6,5 5,5 4,1 3,7 КЛ: Определение состава комплекса Цит-KJI в гидрофобной среде Методом спектрофотометрии показано, что цитохром с при взаимодействии с кардиолипином экстрагируется в гидрофобную среду в виде комплекса определенного состава. Готовили смеси цитохрома с с кардиолипином различного состава и экстрагировали в смесь метанол: Исследование кристаллической структуры осадка комплекса Цит-КЛ Цитохром с в присутствии кардиолипина образует нерастворимый в одной среде комплекс. Если принять диаметр молекулы Рис. О с КЛ , мкМ цитохрома с 5 нм свободный цитохром с имеет диаметр глобулы 4 нм, но данный параметр увеличивается при внедрении жирнокислотных остатков кардиолипина внутрь глобулы , а длину молекулы кардиолипина 3 нм, то при перпендикулярном расположении кардиолипина к поверхности получим диаметр глобулы около 11 нм. Влияние рН и концентраций субстратов на пероксидазную активность комплекса Цит-КЛ Исследовалось влияние рН на интенсивность хемилюминесценции при окислении люминола в системе с Цит-КЛ при различных соотношениях А Б КЛ: По аналогии с известными реакциями пероксидаз и на основании экспериментальных данных была предложена следующая схема схема 2 реакций окисления люминола в системе Цит-КЛ: Прежде всего, 14 очень велика скорость реакции 1 образование комплекса Цит-КЛ и можно считать, что в присутствии всех компонентов системы сразу начинается реакция 2 и последующие на схеме 2. Действие антиоксидантов на пероксидазиую активность Цит-КЛ Влияние антиоксидантов на пероксидазиую активность комплекса Цит-КЛ изучали с помощью разработанной хемшпоминесцентной методики. После добавления антиоксиданта хемилюминесценция развивается с некоторой задержкой рис. Аналогичные результаты были получены для аскорбата натрия и кверцетина. Моделирование осуществляли по следующей схеме реакций: Образование липопероксильных радикалов при окислении липидов в присутствии цитохрома с и комплекса Цнт-KJI В этих исследованиях в качестве липидного субстрата использовали линолевую кислоту. Таким образом, в наших опытах с линолевой кислотой последняя играла роль не 17 только субстрата, но и молекулы, образующей с цитохромом с комплекс Цит-ЛК , по свойствам и функции аналогичный комплексу Цит-КЛ. Зависимость светосуммы о о кислородосодержащих продуктов перекисного окисления липидов максимумы поглощения и нм рис. А нм Схема 5 В следующей серии экспериментов было показано увеличение количества липопероксильных радикалов светосуммы хемилюминеценции при введении пероксида водорода в систему, содержащую линолевую кислоту, цитохром с и кумарин С Данный факт говорит о том, что Цит-JIK проявляет липопероксндазную активность, а образование дополнительных липопероксильных радикалов можно объяснить, предположив схему реакций 6: Действие О 1 Время, мин ВЫВОДЫ 1 Цитохром с, взаимодействуя с кардиолипином в водной среде, образует кристаллический осадок, межплоскостные размеры которого зависят от рН 10,5 нм при рН 7,4 и 7,0 нм при рН 3,7. Москва, Оглавление 1. Актуальность работы 7 1. Цели и задачи 7 1. Научная новизна работы 8 1. Практическое значение работы 9 1. Положения, выносимые на защиту 9 2. Обзор литературы 10 2. Структура и функция цитохрома с 10 2. Особенности строения молекулы цитохрома с 10 2. Функция цитохрома с в организме 12 2. Определение апоптоза и его значение для организма 14 2. Механизм апоптоза 16 2. Роль цитохрома с в апоптозе 18 2. Взаимодействие цитохрома с с кардиолипином 21 2. Взаимодействия цитохрома с с липидными мембранами 23 2. Изменение конформации цитохрома с при связывании с мембранами, содержащими кардиолипин 27 2. Взаимодействие цитохрома с с гигантскими однослойными липосомами 32 2. Наносферы комплекса Цит-КЛ 33 2. Пероксидазная функция комплекса цитохрома с с кардиолипином 35 2. Пероксидазная активность цитохрома с и её изменение при химической модификации белка 35 2. Пероксидазная активность мембрано-связанного цитохрома с 37 2. Механизм пероксидазных реакций, катализируемых комплекса цитохрома с с кардиолипином 38 2 2. Способы регуляции пероксидазной функции комплекса цитохрома с с кардиолипином 39 2. Взаимодействие комплекса цитохрома с с кардиолипином с липидами 42 2. Перекисное окисления липидов и липоксигеназная активность 42 2. Материалы и методы 47 3. Определение стехиометрического соотношения липид: Малоугловое рентгеновское рассеяние 48 3. Спектрофотометрия в гидрофобной среде 49 3. Разработка методики определения антиоксидантов 51 3. Действие антиоксидантов на пероксидазную фукцию комплекса Цит-КЛ 53 3. Пероксидазная активность раствора над осадком комплекса Цит-КЛ 54 3. Пероксидазная активность комплекса Цит с линолевой кислотой 54 3. Подбор физического активатора 55 3. Взаимодействие комплекса Цит-КЛ с гидропероксидами липидов 65 3. Действие антиоксидантов на липоокислительную функцию комплекса цитохрома с с липидами 67 3. Определение гидропероксидов липидов после взаимодействия Цит и линолевой кислотой 67 3. Определение продуктов взаимодействия линолевой кислоты с Цит 67 3. Липопероксидазная активность цитохрома с 68 3. Математическое моделирование 68 3. Статистический анализ 69 4. Разработка методик 69 4. Разработка методики определения антиоксидантов 69 4. Математическое моделирование действия антиоксидантов 73 4. Подбор физического активатора хемилюминесценции 74 4. Разработка методики определения гидропероксидов липидов 77 4. Изучение структуры и состава комплекса цитохрома с с кардиолипином 82 5. Определение состава осадка комплекса Цит-КЛ и его растворимости 82 5. Малоугловое рентгеновское рассеяние 86 5. Спектрофотометрия в гидрофобной среде 87 6. Пероксидазная и липоокислительная функция комплекса цитохрома с с кардиолипином 89 6. Изучение пероксидазной функции комплекса цитохрома с с кардиолипином и жирными кислотами 89 6. Влияние рН и концентраций субстратов на пероксидазную активность комплекса Цит-КЛ 89 6. Математическое моделирование механизма пероксидазного действия комплекса Цит-КЛ 92 6. Пероксидазная функция комплекса Цит с линолевой кислотой 93 6. Определение пероксидазной активности комплекса Цит-КЛ 94 6. Действие антиоксидантов на пероксидазную функцию Цит-КЛ 96 6. Действие антиоксидантов на пероксидазную функцию пероксидазы из корней хрена 97 6. Пероксидазная активность раствора над осадком комплекса Цит-KJI 98 6. Исследование взаимодействия цитохрома с и комплекса Цит-KJI с липидами 6. Взаимодействие комплекса Цит-KJI с липидами 6. Взаимодействие Цит с Г-ВHP 6. Определение гидропероксидов липидов после реакции между Цит и линолевой кислотой 6. Определение продуктов взаимодействия линолевой кислоты с Цит 6. Разрушение Цит при взаимодействии с линолевой кислотой 6. Действие антиоксидантов на липоокислительную функцию комплекса цитохрома с с липидами 6. Липопероксидазная активность цитохрома с 7. Обсуждение результатов 7. Структура и состав комплекса цитохрома с с кардиолипином 7. Пероксидазная функция комплекса цитохрома с с кардиолипином 7. Взаимодействия цитохрома с и комплекса Цит-KJI с липидами 8. Список цитируемой литературы Список сокращений Принятые сокращения: Актуальность работы В году была впервые описана одна из форм гибели клеток - апоптоз [1]. Цели и задачи Целью данной работы было изучение структуры и состава комплекса Цит-КЛ, полученного в разных условиях, а также его пероксидазной и липопероксидазной функции на основе критического пересмотра литературных данных и разработки новых аналитических методик. Научная новизна работы В данной работе было показано, что цитохром с образует с кардиолипином комплексы определенного состава, плохо растворимые в воде. Структура и функция цитохрома с 2. Особенности строения молекулы цитохрома с Цитохром с - водорастворимый белок небольших размеров молекулярная масса около 12 кДА , состоящий из белковой части и гемма с. Гем цитохрома с [5]. Число аминокислотных замен в Цит различных организмов по сравнению с Цит человека. Вид Количество замен Вид Количество замен Шимпанзе 0 Лягушка 18 Обезьна резус 1 Карп 18 Кролик 9 Шелковичная бабочка 31 Собака 11 Пшеница 43 Курица 13 Дрожжи Saccharomyces 45 Цитохром с - консервативный белок, однако чем дальше филогенетически расположены организмы, тем больше различий в структуре этого белка. Группа гема соединена пятой и шестой координационными связями атома железа с имидазольным кольцом Гис и атомом серы Мет, что также отличает цитохромы от гемоглобина, в которой координационная связь 11 шестая железа свободна, что позволяет присоединять, переностить и отсоединять в нужный момент кислород. Функция цитохрома с в организме Одной из важных функций Цит в живом организме является его участие в клеточном дыхании. Комплекс I Комплекс III Комплекс IV АТФ-синтаза Рис. Митохондриальная дыхательная цепь [10]. Помимо вышеописанной функции, окисленная форма цитохрома с способна окислять супероксидный радикал с образованием молекулярного кислорода [13]: Алексеев, Андрей Владимирович кандидата биологических наук Москва, ВАК Купить - р. Пероксидация липидов под действием цитохрома c и его комплекса с анионными липидами и ее роль в апоптозе Молекулярные механизмы взаимодействия митохондриальных фосфолипидов с цитохромом c Самоинактивация цитохромов Р при химическом восстановлении и в процессе катализа Тест-система на основе мутантных форм цитохрома c для количественного определения супероксидного анион-радикала Сравнение физико-химических свойств цитохрома Р 2В4, встроенного в протеолипосомы, со свойствами микросомального цитохрома Р Цена и условия доставки. Биология развития, эмбриология Общая и региональная геология Геология океанов и морей Геология, поиски и разведка рудных и нерудных месторождений Ветеринарная санитария, экология, зоогигиена и ветеринарно-санитарная экспертиза Физическая география, геофизика и геохимия ландшафтов Геоморфология и эволюционная география Гидрология суши, водные ресурсы, гидрохимия Метеорология, климатология, агрометеорология Географическая картография и геоинформатика Инженерная геология, мерзлотоведение и грунтоведение Технология бурения и освоения скважин Геотехнология подземная, открытая и строительная Физика атмосферы и гидросферы
Фото ебли крупний план
Не хочу работатьв школечто делать
Говядина со спаржей
Сколько стоит реклама на авито
Стихи для школьного фотоальбома
Состав семян подсолнечника таблица
Официальный сайт путина написать электронное письмо
Гана на карте мира
Реклама лекарства от простуды
Калькулятор решений уравнений с дробями
Везение в азартных играх
Сделать аккаунт gmail
Мистик и лаггер и макс прохождение карт
Значение числа 113
2.1 технико экономическая характеристика предприятия