Ссылка на файл: >>>>>> http://file-portal.ru/Дезинфекция в микробиологической лаборатории рук рабочего места/
Правила забора материала для микробиологических исследований
Дезинфекция в микробиологической лаборатории
Дезинфекция
Предназначено для студентов факультета ветеринарной медицины по специализации ветеринарный врач—бактериолог, ветсанэксперт и студентов факультета биотехнологии по специализации технолог. Предлагаемое учебно-методическое пособие не может заменить практическую работу в лаборатории кафедры, и это не лабораторный практикум в его классическом понимании, но оно позволит студентам лучше подготовиться к экзаменам как по первому модулю, так и по всему курсу микробиологии. Данное учебно-методическое пособие подготовлено применительно к вузовскому курсу для студентов факультета ветеринарной медицины специализаций ветеринарный врач-бактериолог и ветсанэксперт и для студентов факультета биотехнологии специализации технолог. Пособие написано заведующим кафедрой микробиологии, вирусологии, эпизоотологии, ВСЭ Ульяновской ГСХА, д. А, профессором кафедры микробиологии и ВСЭ Саратовского ГАУ, д. В, руководителем курса микробиологии Ульяновской ГСХА к. Это задача следующих изданий — по частной и санитарной микробиологии. Кохом техника использования чистых культур и впервые примененные Л. Однако, в отличие от лабораторных практикумов по курсу микробиологии для вузов, она по некоторым разделам изложена более детально и носит справочный характер. Данная структура учитывает особенность подготовки и специализации врачей-бактериологов и ветсанэкспертов. Бактериологические лаборатории как структурные единицы организуются в составе областных, районных, межрайонных ветеринарных лабораториях, а также в структуре зональных ветеринарных лабораторий. Бактериологические лаборатории входят в состав специализированных научно-исследовательских учреждений. Бактериологические лаборатории постоянно используются для подтверждения или установления оценки пригодности мяса на пищевые цели по ВСЭ. Продукты питания, образцы мяса и мясопродуктов, молока и молокопродуктов, которым необходимо дать оценку на пригодность для пищевых целей. В состав бактериологической лаборатории входят: Помещения микробиологических лабораторий по степени опасности для персонала разделяются на 2 зоны:. Под лабораторные комнаты, в которых производят все бактериологические исследования, отводят наиболее светлые, просторные помещения. Стены в этих комнатах на высоту см от пола окрашивают в светлые тона масляной краской или покрывают кафелем. Пол застилают релином или линолеумом. В одной из комнат оборудуют застекленный бокс - изолированное помещение с тамбуром предбоксником для выполнения работ в асептических условиях. В боксе ставят стол для посевов, табурет, над рабочим местом монтируют бактерицидные лампы. В предбокснике помещают шкаф для хранения стерильного материала. Окна и двери помещений "заразной" зоны должны быть герметичными. Имеющаяся вытяжная вентиляция из "заразной" зоны должна быть изолирована от других вентиляционных систем и оборудована фильтрами тонкой очистки воздуха. Очень большое значение для работы имеет правильная организация рабочего места врача-бактериолога и лаборанта. Лабораторные столы устанавливают около окон. При размещении их нужно стремиться к тому, чтобы свет падал спереди или сбоку от работающего, лучше с левой стороны, но ни в коем случае не сзади. Желательно, чтобы комнаты для проведения анализов, особенно для микроскопирования, имели ориентацию окон на север или северо-запад, так как для работы необходим ровный рассеянный свет. Освещенность поверхности столов для работы должна быть лк. Для удобства дезинфекции поверхность лабораторных столов покрывают пластиком или обивают железом. Все рабочие места оборудуют предметами, необходимыми для повседневной бактериологической работы, перечень которых дан в таблице. Необходимые предметы для бактериологической работы. Набор красок и реактивов для окраски. Пипетки, градуированные на 1, 2, 5, 10 мл. По 25 каждого объема. Емкости с дезинфицирующими растворами. Масленка с иммерсионным маслом. Банка с дезинфицирующим раствором для пипеток. Спиртовая или газовая горелка. Установка для окраски препаратов. Песочные часы на 1 или 2 минуты. Груша с резиновой трубкой. Банка со спиртовыми ватками. Особенностью бактериологических работ является постоянное соприкосновение сотрудников лаборатории с заразным материалом, культурами патогенных микробов, зараженными животными и выделениями больных. Поэтому все сотрудники бактериологической лаборатории обязаны соблюдать правила работы, которые обеспечивают стерильность и предупреждают возможность возникновения аварий - нештатных ситуаций, при которых создается реальная или потенциальная возможность выделения патогенного агента в воздух производственной зоны, окружающую среду или заражения персонала. В помещение бактериологической лаборатории нельзя входить без специальной одежды — халата, белой шапочки или косынки, сменной обуви. При распаковке присланного заразного материала необходимо соблюдать осторожность: Инструменты, использованные в работе с заразным материалом, тотчас после их употребления дезинфицируют, как и поверхность рабочего места. При выполнении бактериологических работ нужно строго следить за чистотой рук: Детальнее техника безопасности при работе в бактериологических лабораториях описана в методических указаниях, составленных Д. Помещение лаборатории ежедневно до начала работы следует убирать влажным способом. Пыль с поверхностей протирают увлажненной тряпкой, смоченной дезинфицирующим раствором. После окончания работы стены, покрытые метлахскими плитками или окрашенные масляной краской, моют горячей водой с мылом или стиральным порошком. Потолки, карнизы, верхнюю часть стен, окрашенные клеевой краской, не реже одного раза в неделю очищают от пыли пылесосом. Подготовка бокса к работе. Помещение бокса регулярно обрабатывают следующим образом: При указанных условиях бокс облучают 2—3 ч. Перед началом работы лампы выключают. По этим же соображениям работа в боксе проводится в стерильных халатах, защитных масках и тапочках, специально предназначенных для бокса. Воздух в боксе следует регулярно, не менее 2 раз в неделю, проверять на бактериальную обсемененность. Для проверки чашки с мясо-пептонным агаром и средой Сабуро оставляют открытыми в течение 15 минут. Допустимым ростом считается не более 5 колоний на чашках. Количество колоний, превышающее 5 при минутной экспозиции, является показателем высокой обсемененности воздуха бокса. Не менее одного раза в неделю помещение бокса моют горячей водой с мылом, дезинфицирующими средствами и протирают досуха. В моечной необходимо иметь кастрюли, тазы, ведра, ерши, щетки и доски с колышками для сушки чистой посуды. На дно раковины кладут густую металлическую сетку, чтобы предупредить засорение канализационной сети частицами агара, ватой, бумагой, попадающими в воду при мытье посуды. Сильно загрязненную посуду со следами жира обрабатывают в хромовой смеси. Работать с хромовой смесью необходимо с осторожностью, в фартуке и резиновых перчатках, после тщательно промывать посуду. Мытье новой лабораторной посуды. После кипячения в кислоте посуду прополаскивают водопроводной водой и дважды дистиллированной. Мытье лабораторной посуды, бывшей в употреблении. Надежный способ мытья и обеззараживания лабораторной посуды предложен Г. Лабораторная посуда хорошо отмывается и обезжиривается в течение 30 минут кипячения в указанном растворе, затем ее прополаскивают водопроводной водой и дважды дистиллированной. После этого посуду высушивают в сушильном шкафу. Для обработки посуды, применявшейся для выращивания микобактерий туберкулеза на яичных питательных средах, А. На стенках плохо обезжиренной посуды при выливании жидкости остается большое количество капель, вследствие чего слитый объем жидкости не будет соответствовать той величине, которая указана на шкале деления. С помощью резинового баллончика, надетого на пипетку, насасывают в нее горячую мыльную воду и затем погружают в сосуд с такой же водой. Для того чтобы загрязнения снимались быстрее и легче, пользуются горячей мыльной водой, раствором питьевой соды или стирального порошка. Закупорившийся канал пипетки прочищают тонкой проволокой или мандреном от тонких игл шприцев. После 20—минутного кипячения пипетки вынимают и несколько раз ополаскивают сначала теплой проточной, а затем дистиллированной водой. Мытье предметных и покровных стекол. Капля воды, нанесенная на обезжиренное стекло, растекается равномерно, а на плохо обезжиренном стекле распадается на мелкие капельки. Сушка и хранение чистой лабораторной посуды. Стекло ее должно быть совершенно прозрачным, без матового налета и пятен. Дезинфекцией является уничтожение микроорганизмов в объектах внешней среды. Дезинфекции подвергают отработанный патологический материал кал, моча, мокрота, различного вида жидкость, кровь перед выбрасыванием его в канализацию. Дезинфекция рук после работы с заразным материалом и при попадании его на кожу. По окончании работы с заразным материалом руки профилактически дезинфицируют. Таким образом, сначала обрабатывают места наименее загрязненные, затем переходят к участкам кожи, загрязненным наиболее сильно. Протирают руки в течение 2 минут двумя тампонами последовательно. После обработки хлорамином руки моют теплой водой с мылом. Стерилизация, в отличие от дезинфекции, предусматривает уничтожение в стерилизуемом объекте всех вегетативных и споровых, патогенных и непатогенных микроорганизмов. Стерилизацию производят различными способами: Выбор того или иного способа стерилизации определяется качеством и свойствами микрофлоры стерилизуемого объекта. Перед стерилизацией лабораторную посуду моют и сушат. Пробирки, флаконы, бутыли, матрацы и колбы закрывают ватно-марлевыми пробками. Поверх пробок на каждый сосуд кроме пробирок надевают бумажные колпачки. Резиновые, корковые и стеклянные пробки стерилизуют в отдельном пакете, привязанном к горлышку посуды. Чашки Петри стерилизуют завернутыми в бумагу по 1—10 штук. Пастеровские пипетки по 3—15 шт. В верхнюю часть каждой пипетки вкладывают кусочек ваты, предупреждающий попадание материала в окружающую среду. При завертывании пипеток нужно соблюдать большую осторожность, чтобы не обломать запаянные концы капилляров. Во время работы пипетки из пакета вынимают за верхний конец. В верхнюю часть градуированных пипеток, как и в пастеровские пипетки, вставляют предохранительную вату и затем заворачивают в плотную бумагу, нарезанную предварительно полосками шириной 2—2,5 см и длиной 50—70 см. Полоску кладут на стол, левый конец ее загибают и завертывают им кончик пипетки, затем, вращая пипетку, навертывают на нее ленту бумаги. Для того чтобы бумага не разворачивалась, противоположный конец ее закручивают или приклеивают. На бумаге надписывают объем завернутой пипетки. Иглу, цилиндр и поршень берут пинцетом, который стерилизуют вместе со шприцем. Такой способ стерилизации получил название прокаливания или фламбирования. После того как он сгорит, петлю переводят в вертикальное положение, накаливают докрасна вначале нижнюю, затем верхнюю часть проволоки и прожигают петледержатель. Подготовка к стерилизации и стерилизация бумаги, марли и ваты. При разрыве пакета стерилизованный материал следует стерилизовать повторно, так как стерильность его нарушается. Стерилизация перчаток и других резиновых изделий. Между перчатками прокладывают марлю. Стерилизация патогенных культур микробов. В стерилизатор наливают дистиллированную воду, так как водопроводная образует накипь. Стеклянные предметы погружают в холодную, металлические предметы—в горячую воду с добавлением гидрокарбоната натрия. Стерилизуемые предметы кипятят на слабом огне минут. Началом стерилизации считается момент закипания воды в стерилизаторе. По окончании кипячения инструменты берут стерильным пинцетом, который кипятят вместе с остальными предметами. Стерилизация сухим жаром производится в печи Пастера. Стерилизация паром под давлением. Стерилизацию паром под давлением производят в автоклаве. Автоклав состоит из двух котлов, вставленных один в другой, кожуха и крышки. Во внутренний котел помещают стерилизуемый материал. Кроме перечисленных основных частей, автоклав имеет ряд деталей, регулирующих его работу: Соотношения показаний манометра и температуры кипения воды. На боковой стенке автоклава имеется водомерное стекло, показывающее уровень воды в водопаровом котле. На дне автоклава находится конденсационный кран для освобождения стерилизационной камеры от конденсата, образующегося в период нагревания стерилизуемого материала. Правила работы с автоклавом. В автоклавах с автоматическим регулированием пара на электровакуумном манометре водопаровой камеры стрелки устанавливают в соответствии с режимом стерилизации: В период заполнения водой вентиль на трубе, по которой пар поступает в камеру, держат открытым для свободного выхода воздуха из котла. Стерилизационную камеру автоклава загружают стерилизуемым материалом. После этого крышку или дверцу автоклава закрывают, плотно закрепляя центральным затвором или болтами; чтобы избежать перекоса, болты завинчивают крест-накрест по диаметру. С началом парообразования и создания давления в водопаровой камере производят продувку удаление воздуха из стерилизационного котла. Способ удаления воздуха определяется конструкцией автоклава. Вначале воздух выходит отдельными порциями, затем появляется ровная непрерывная струя пара, указывающая, что из стерилизационной камеры воздух полностью вытеснен. После удаления воздуха кран закрывают, и в стерилизационной камере начинается постепенное повышение давления. Началом стерилизации считается тот момент, когда стрелка манометра показывает заданное давление. После этого интенсивность подогрева уменьшают, чтобы давление в автоклаве в течение нужного времени оставалось на одном уровне. По окончании времени стерилизации подогревание прекращают. Закрывают вентиль в трубопроводе, подающем пар в стерилизационную камеру, и открывают вентиль на конденсационной нисходящей трубе для снижения давления пара в камере. Биотесты изготовляются бактериологическими лабораториями ЦСЭН. В случае непрохождения данных тестов производят проверку технического состояния автоклава. Стерилизация текучим паром производится в текучепаровом аппарате Коха или в автоклаве при незавинченной крышке и открытом выпускном кране. Аппарат Коха представляет собой металлический полый цилиндр с двойным дном. Началом стерилизации считается время с момента закипания воды и поступления пара в стерилизационную камеру. Тиндализацией пользуются для обеспложивания питательных сред, содержащих белок. Механическая стерилизация с помощью бактериальных ультрафильтров. Для изготовления ультрафильтров применяют мелкопористые материалы каолин, асбест, нитроцеллюлоза и др. Асбестовые фильтры фильтры Зейтца представляют собой асбестовые пластинки толщиной 3—5 мм и диаметром 35 и мм для фильтрации малых и больших объемов жидкости. В нашей стране асбестовые фильтры, изготовляют двух марок: Асбестовые фильтры используются однократно. Мембранные ультрафильтры изготавливаются из нитроцеллюлозы и представляют собой диски белого цвета диаметром 35 мм и толщиной 0,1 мм. Средний диаметр пор, мкм. Он состоит из 2-х частей: Опорная часть аппарата имеет форму воронки, суживающаяся часть которой находится в резиновой пробке горлышка колбы Бунзена. В рабочем состоянии верхнюю часть прибора фиксируют на нижней с помощью винтов. Перед началом фильтрации места соединения различных частей установки для создания герметичности заливают парафином. После этого в цилиндр или воронку аппарата наливают фильтруемую жидкость и включают насос, создающий вакуум в приемном сосуде. В результате образующейся разности давлений фильтруемая жидкость проходит через поры фильтра в приемник. Микроорганизмы остаются на поверхности фильтра. Микроскопический метод исследования предусматривает наблюдение за живыми и убитыми микробами в окрашенном и неокрашенном состоянии. Различают простые и сложные способы окраски. Первые основаны на применении какой-либо одной краски, например, метиленового синего или фуксина. Сложные методы окраски позволяют обнаруживать в теле микробной клетки различные структурные элементы капсулы, споры, включения , помогают дифференцировать сходные по величине и форме бактерии, принадлежащие к различным группам. Ниже мы приводим методы, которые часто используются при исследовании живых клеток в целях идентификации. Скорость перемещения бактерий варьирует, и медленно движущиеся организмы следует отличать от тех, которым свойственно лишь броуновское движение. Описаны некоторые неподвижные мутанты, обладающие жгутиками. Иммерсионная жидкость на конденсор не наносится, а положение конденсора, для которого характерно самое хорошее темное поле, находится экспериментальным путем. С помощью этого ухищрения оказывается возможным увидеть под малым увеличением даже спирохеты. Часто в первичной среде выделения скольжение не выявляется; обычно его легче обнаружить на твердых средах с небольшим количеством питательных веществ, соответствующих их содержанию в естественной для данной группы среде обитания. Роение—это распространение микроорганизмов по относительно сухой поверхности, например, агара, где они движутся в виде больших протяженных островков или микроколоний. Для этого покровное стекло ставят на ребро у края капли и, опуская, постепенно вытесняют воздух, находящийся между предметным и покровным стеклами, чтобы избежать образования пузырьков. В правильно приготовленном препарате раздавленной капли стекла плотно склеиваются и жидкость тончайшим слоем заполняет пространство между ними, не выступая за края покровного стекла. На середину необезжиренного покровного стекла наносят небольшую, с четкими краями каплю бульонной культуры. Каплю материала покрывают предметным стеклом с лункой, края которой предварительно смазывают вазелином. Предметное стекло с прилипшим к нему покровным стеклом перевертывают. Капля оказывается висячей в герметически закрытой влажной камере, из которой жидкость испаряется очень медленно, и поэтому препарат долгое время остается пригодным для наблюдения. Висячую каплю микроскопируют с плоским зеркалом и суженной диафрагмой. Живые микробы, находящиеся в препарате раздавленной капли, можно изучать и в темном поле зрения. При этом методе микроскопии толщина предметных стекол не должна превышать 1,2 мм, покровных—0,2 мм. Принцип исследования микробов в темном поле зрения заключается в том, что в объектив и, следовательно, в глаз наблюдателя попадают не прямые лучи света, а отраженные исследуемым объектом. Для создания темного поля конденсор Аббе заменяют темнопольным конденсором, имеющим затемнение центральной части. На покровное стекло наносится вторая капля масла. Наносить масло на обе поверхности препарата необходимо для того, чтобы при микроскопии с иммерсионной системой проходящие лучи света не преломлялись. Метод висячего агарового слоя. Затем кладут покровное стекло на предметное пленкой вниз и фиксируют его положение одной-двумя каплями свечного воска. В результате видимый размер бактерии оказывается больше, чем действительный, даже если нет капсулы. Для изучения микроорганизмов в окрашенном виде на предметном стекле делают мазок, высушивают, фиксируют его и после этого окрашивают. Техника приготовления мазков определяется характером исследуемого материала. Приготовление мазков из крови. Толщина мазка зависит от величины угла между стеклами: На середину предметного стекла пастеровской пипеткой наносят каплю крови или прикладывают стекло непосредственно к выступающей капле крови. Стекло оставляют в горизонтальном положении до высыхания крови. Мокроту или гной, нанесенные на предметное стекло ближе к узкому краю, накрывают другим предметным стеклом. Стекла слегка придавливают друг другу. После этого свободные концы стекол захватывают 1 и 2 пальцами обеих рук и разводят в противоположные стороны так, чтобы при движении оба стекла плотно прилегали друг к другу. Получаются мазки с равномерно распределенным материалом, занимающим большую площадь. Приготовление мазка из культур с плотных питательных сред. Приготовление мазков из органов и тканей. Далее поступают так же, как при приготовлении мазка из гноя и мокроты. Если ткань органа плотная, то из глубины разреза делают скальпелем соскоб. Высушивание и фиксация мазков. Приготовленный на предметном стекле мазок высушивают на воздухе и после полного высыхания фиксируют. При фиксировании мазок закрепляется на поверхности предметного стекла, и поэтому при последующей окраске препарата микробные клетки не смываются. Кроме того, убитые микробные клетки окрашиваются лучше, чем живые. Различают физический способ фиксации, в основу которого положено воздействие высокой температуры на микробную клетку, и химические способы, предусматривающие применение средств, вызывающих коагуляцию белков. Нельзя фиксировать над пламенем мазки, содержащие возбудителей I — II групп патогенности. Предметное стекло с препаратом берут пинцетом или I и II пальцами правой руки за ребра мазком кверху и плавным движением проводят 2—3 раза над верхней частью пламени горелки. Весь процесс фиксации должен занимать не более 2 с. Надежность фиксации проверяют следующим простым приемом: Для фиксации мазков применяют также химические вещества и соединения, приведенные в таблице 4. Вещества для химической фиксации. Жидкость Никифорова смесь этилового спирта и эфира в соотношении 1: Предметное стекло с высушенным мазком погружают в склянку с фиксирующим веществом и затем высушивают на воздухе. Для окраски мазков пользуются растворами красок или красящей бумагой, что предложено А. Простота приготовления, удобство применения, а также возможность хранения красящей бумаги в течение неограниченно долгого времени явились основанием для широкого их использования при различных способах окраски. Окраска мазков красящей бумагой. В течение всего времени окрашивания бумага должна оставаться влажной и плотно прилегать к поверхности стекла. При подсыхании бумагу дополнительно смачивают водой. Окраска мазков растворами красителей. Окраска бывает простая и сложная. Простая окраска заключается в нанесении на мазок какой-либо одной краски на определенный промежуток времени. Кислый фуксин совершенно непригоден для окраски бактерий. При простой окраске микробные тела воспринимают цвет применяемой краски так же интенсивно, как и ядра клеток; в то же время цитоплазма и весь фон мазка если это не мазок из чистой культуры окрашиваются в тот же цвет, но несколько бледнее. Восприятие окраски зависит не только от свойств красок, но и от свойств подвергаемых окраске микробов. Большинство микробов легко и быстро окрашивается водными или спирто-водными растворами красок. Для трудно воспринимающих окраску микробов например, возбудитель туберкулеза или их частей споры, жгутики и пр. Для повышения красящей способности воздействуют на краску высокой температурой нагреванием до появления паров вплоть до кипения. Варьируя степень нагревания, можно получать различные степени силы окраски. Удлинение срока воздействия красящего раствора на объект также может в известной мере усилить степень окраски. Протравами являются вещества, облегчающие проникновение краски внутрь клеток: Механизм действия протрав различен: При окраске мазков, кроме красок, применяются еще так называемые обесцвечивающие или раскрашивающие вещества. В качестве обесцвечивающих веществ применяются: Флаконы должны быть снабжены этикетками с соответствующими обозначениями; во избежание быстрого загрязнения красками этикетки рекомендуется пропитывать расплавленным парафином при помощи кисточки. Флаконы с красками помещают в деревянный штатив - колодку рис. Подставка-мостик представляет собой две стеклянные трубки или палочки, соединенные на концах отрезками резиновых трубок. Поэтому необходима достаточная фиксация мазков. При простом методе окраски на фиксированный мазок наливают несколько капель какого-либо спирто-водного или водного раствора краски на 1—2 минуты; чаще всего для этой цели применяется фуксин 1: Затем краску смывают дистиллированной водой и мазок обсушивают между двумя полосками фильтровальной бумаги. Фуксин окрашивает мазки более интенсивно, а при окраске метиленовой синькой получаются нежные, более изящные препараты. Мазок после обсушивания фильтровальной бумагой должен быть совершенно сухим, в противном случае при соприкосновении оставшейся влаги с кедровым маслом образуется эмульсия и при микроскопии получится неясное изображение. Вообще, продолжительность окраски зависит от вида и качества красящего раствора, степени восприимчивости микроба к окраске и толщины мазка. После растворения краски оба раствора смешивают и профильтровывают через бумажный фильтр. Краска сохраняется долгое время. Мазки красят через полоски фильтровальной бумаги в течение 15 — 30 секунд. Фиксацию мазков автор рекомендует производить смесью спирта 80 частей с формалином 20 частей в течение 3—10 минут. При данной окраске мазков в микробных клетках выявляются включения, биполярность, капсулы и споры. Метод удобен для окраски мазков из органов, крови, культур на средах с нативным белком и на полужидком агаре. Фон препарата из указанных субстратов розовый; клетки ткани и микробные тела окрашиваются в голубовато-синие цвета. Сложные методы окраски основаны на особенностях физико-химического строения микробной клетки. Сущность этих методов заключается в воздействии на мазок двух красящих веществ, из которых одно является главной основной краской, а другое — дополнительной контрастной. После воздействия первой краской мазок обесцвечивают и только после этого подвергают дополнительной окраске. В качестве обесцвечивающих веществ может быть применен целый ряд химических реагентов кислоты, щелочи, спирт, ацетон и др. Промывание мазка простой водой также является чисто механическим процессом обесцвечивания, но для этого необходимо продолжительное время; кроме того, обесцвечивание получается неполным. По отношению к обесцвечивающим веществам можно разбить микробов на группы легко и трудно обесцвечиваемых. Не все виды микробов одинаково относятся к обесцвечивающим реагентам; некоторые являются кислото- и спиртоустойчивыми, другие только кислотоустойчивыми. Наконец, некоторые, например, споры, энергично противостоят воздействию всех обесцвечивающих веществ и относятся к группе краскоустойчивыx. Сложные методы окраски имеют важное дифференциально-диагностическое значение для характеристики изучаемого микроба. При обработке мазков срезов из органов и тканей, содержащих микроорганизмы, генцианвиолетом, а затем йодом, препарат, окрашенный в черный цвет, обладает свойством обесцвечиваться под действием спирта. При дополнительной окраске в частности, фуксином Пфейффера обесцвеченные спиртом бактерии окрашиваются в красный цвет грамотрицательные. Разница между грамположительными и грамотрицательными бактериями зависит от различия их изоэлектрических точек, а способность грамположительных бактерий удерживать окраску связана с присутствием в них магниевой соли рибонуклеиновой кислоты, которой грамотрицательные бактерии не содержат. Лучше всего окраска по Граму получается после фиксации мазков физическим методом нагреванием. Особенности отношения тех или иных видов бактерий к разным краскам, в частности, к окраске по методу Грама, характеризуют так называемые тинкториальные свойства микробов. На фиксированный жаром мазок кладут полоску фильтровальной бумаги величиной немного короче и уже предметного стекла, наливают на нее достаточное количество раствора кристаллвиолета, карболового или же анилинового раствора генцианвиолета, или другой какой-либо фиолетовой трифенилметановой краски напримep метилвиолета на 1—2 минуты. Затем краску сливают, удаляют полоску фильтровальной бумаги и, не смывая водой, наливают на мазок раствор Люголя на 1—2 минуты. Затем краску смывают водой, а мазок высушивают чистой фильтровальной бумагой. Нельзя пользоваться загрязненной фильтровальной бумагой: Продолжительность воздействия краской, раствором Люголя протравой и спиртом зависит от толщины мазка. Особенно ответственным моментом в окраске по Граму является обесцвечивание мазка спиртом. При коротком воздействии спирта получаются перекрашенные препараты, а при длительном все микробы в том числе и rpaмположительные обесцветятся. На густой, толстый мазок например, из агаровой культуры время воздействия спиртом должно быть большим, нежели на тонкий мазок, особенно с жидких культур. Иногда в культуре грамположительных бактерий могут наблюдаться грамотрицательные особи, которых тем больше, чем старше популяция. Это ничто иное, как бактериальные трупы, претерпевшие внутриклеточный автолиз, в результате которого клетка лишилась рибонуклеинатов магния. С другой стороны, в очень молодых культурах несколько часов роста из семейства энтеробактерий гигантские, юные формы этих бактерий, которые в 2—3 раза крупнее взрослых особей часовых , очень базофильны вследствие перегрузки их цитоплазмы рибонуклеинатами. Поэтому при окраске по Граму они окрашиваются фуксином так интенсивно, что при плохом освещении их можно принять за грамположительные вегетативные формы спороносных палочек. Обесцвечивание считается законченным, когда стекающие с мазка капли спирта сравняются по цвету со спиртом в кюветке; обычно для этого требуется 10—30 секунд, в зависимости от толщины мазка. Отработанный спирт обычно сливают из кюветок в спиртовые горелки. Для начинающих можно рекомендовать обесцвечивание мазков йодированным спиртом. Установлено, что если к обесцвечивающей жидкости добавить немного йодной настойки, то микробы, окрашивающиеся грамположительно, не обесцвечиваются в такой жидкости даже в течение часа, а грамотрицательные раскрашиваются приблизительно в 5 секунд. В том случае, если вместо спирта используют ацетон, йодную настойку прибавляют перед использованием. Как уже упоминалось выше, окраска по Граму представляет собой самый важный метод идентификации бактерий. Теоретически возможно разделить бактерии на две группы: С тех пор, как метод был впервые разработан Кристианом Грамом в г. Растворы А и Б смешивают для получения красящего реактива кристаллического фиолетового. Хранят в темной склянке. Промывают его в слабой, идущей под углом струе водопроводной воды в течение 2 с, после чего подсушивают промокательной бумагой. Промывают мазок в слабой, идущей под углом струе водопроводной воды до исчезновения окраски в стоке, после чего подсушивают промокательной бумагой. Отмывают мазок йодной протравой, после чего покрывают его на 2 минуты свежей протравой. Поверхность вокруг мазка подсушивают промокательной бумагой, но сам мазок предохраняют от высыхания. Мазок промывают в слабой, идущей под углом струе водопроводной воды до исчезновения окраски в стоке и подсушивают фильтровальной бумагой. Некоторые виды рода Bacillus грамположительны лишь в течение нескольких делений после прорастания спор. Целесообразно в качестве контроля использовать известные грамположительные и грамотрицательные микроорганизмы. Кристаллвиолет может быть заменен метилвиолетом или генцианвиолетом в равных количествах. Через сутки стояния раствор краски готов и может сохраняться долгое время. Техника окраски та же. На фиксированный мазок наливают 2—3 капли дистиллированной воды, опускают и придавливают к стеклу пинцетом полоску бумаги, приготовленной вышеуказанным способом. Бумажку через 2 минуты смывают водой или, лучше, снимают пинцетом. Дальше производится обработка раствором Люголя, спиртом или йодированным спиртом, водой и дополнительная окраска. Модификация по Синеву особенно удобна для походных лабораторий, в экспедиционной работе и т. Клемпарская рекомендует готовить красящие бумажки для метода Грама и Циль-Нильсена по следующей прописи: Растворы красок получаются очень стойкие и совершенно не дают осадков. Для окраски необходимы следующие растворы:. При отсутствии готового сернокислого анилина таковой может быть приготовлен следующим образом. После растворения прибавляют 90 мл дистиллированной воды. Для дополнительной окраски применяют спирто-водный сафранин можно везувин или пиронин: Фиксированный на пламени мазок покрывают полоской фильтровальной бумаги, наливают на нее карболовый раствор фуксина и подогревают; при появлении паров прекращают нагревание и оставляют краску на препарате еще на несколько минут 2—3 минуты. Дав препарату остыть, удаляют пинцетом бумажку и промывают мазок водой. Докрашивают в течение 3—5 минут леффлеровской метиленовой синькой или водным раствором 1: После этого мазок ополаскивают водой и докрашивают метиленовой синькой по основной прописи. Указанным методом достигается одновременное испытание бацилл на кислото- и спиртоустойчивость. Среди видов кислотоустойчивых сапрофитов встречаются спиртоподатливые разновидности, палочки же туберкулеза и паратуберкулеза всегда кислото- и спиртоустойчивы. На фиксированный мазок наносят несколько капель дистиллированной воды, накладывают полоску окрашенной бумаги, нагревают до появления паров и далее обрабатывают по оригинальной прописи Циль-Нильсена. Кислотоустойчивость того или иного микроорганизма можно определить флуоресцентным методом. Погружают мазок в дополнительный краситель на 2—4 минуты. Отмывают дистиллированной водой, как описано выше, и подсушивают фильтровальной бумагой. Для микроскопической дифференциальной диагностики туберкулезных палочек от спиртоподатливых сапрофитов существует несколько методов. Окрашивают при подогревании карболовым раствором фуксина. Докрашивают насыщенным спиртовым раствором метиленовой синьки не менее 5 минут. Мазок обмывают водой, высушивают. Если требуется проверить в уже окрашенном по Циль-Нильсену мазке обнаруженные кислотоустойчивые палочки на спиртоустойчивость, нужно: Кислото- и спиртоустойчивые палочки сохраняют свой красный цвет, а спиртоподатливые окрасятся в синий цвет. Не промывая водой, на мазок наливают раствор Люголя на 10—15 минут;. Обесцвечивают смесью спирта и ацетона 1: Дополнительно окрашивают разведенным 1: Мазок сначала окрашивают смесью из 3 частей карболового раствора фуксина с 1 частью метилвиолета по Муху см. Для окраски смешивают 2 части раствора А с 1 частью раствора Б. На фиксированный мазок наливают смесь растворов А и Б , через минуту краску сливают, мазок обрабатывают раствором Люголя в течение минуты, затем промывают водой и докрашивают в течение 2—3 минут раствором хризоидина 1 г краски в мл дистиллированной горячей воды , промывают водой и высушивают. На фиксированный мазок наливают краску и нагревают 1—2 минуты, до появления паров. При микроскопии с искусственным освещением метахромазия заметна особенно резко. Дают мазку остыть, смывают водой бумажку с краской, сушат и исследуют. Лучше применять краску фабричного изготовления. Перед самой окраской готовят рабочий раствор из расчета 1 капля краски на 1 мл дистиллированной воды нейтральной реакции определение рН воды см. Указанный способ особенно хорош для окраски спирохет, биполяров и мазков крови. Простой способ нейтрализации дистиллированной воды. При рН воды 5,4—5,5 кислая реакция получается свекловично-красная рубиновая окраска. Нельзя добавлять соду до получения ясно оранжевого или, тем более, желтого цвета; в таких случаях вода окажется сильно щелочной. Зная, сколько капель раствора соды пошло на усреднение мл исследуемой пробы, легко подсчитать, сколько надо взять капель для нейтрализации любого количества той же порции воды. Для окраски лучше применять воду с рН 6,8 — 7,0. Капсулы микробов состоят главным образом из полисахаридов и гликопротеидов. Капсульными можно считать те микробы, у которых капсула обнаруживается при окраске каким-либо методом на капсулы. Капсулы и слои слизи образуются некоторыми бактериями в специфических культуральных условиях. На чистое предметное стекло петлей наносят тушь и смешивают ее с культурой. Подсушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют. Фиксированный мазок преимущественно из крови или селезеночной пульпы окрашивают леффлеровской метиленовой синькой в течение 2—3 минут при подогревании до появления паров. Затем краску быстро смывают водой и мазок высушивают фильтровальной бумагой. Лучше окрашивать старым раствором краски. Раствор сафранина готовят перед употреблением, растворяя краску в горячей воде с последующим фильтрованием. Быстро смывают водой, высушивают. Затем этот насыщенный при комнатной температуре раствор фильтруют, после чего он готов к употреблению. Окрашивают нефиксированный мазок указанным выше раствором в течение 15—20 секунд, быстро промывают водой и высушивают. С успехом можно окрашивать капсулы краской Романовского-Гимза. На фиксированный мазок наносят раствор краски 2 капли краски на 1 мл дистиллированной воды на 15—20 минут. Краску быстро смывают водой и мазок высушивают фильтровальной бумагой. Для выявления капсульных микробов в культурах предлагается следующий способ: Мазок окрашивают леффлеровской метиленовой синькой в течение 2—3 минут. Зрелые споры обычными растворами красок не окрашиваются. В микробной клетке споры располагаются или в центре ее экваториально , или на конце терминально , или ближе к концу палочки субтерминально. Споры имеют очень плотную оболочку, состоящую из наружного и внутреннего слоев. Все специальные методы окраски спор основаны на действии различных протрав, изменяющих структуру оболочки и тем облегчающих проникновение в споры красящего вещества. Имеется несколько удовлетворительных методов для окрашивания эндоспор в бактериях. Насыщают бумагу раствором карболового фуксина и выпаривают его минут, как описано выше, поддерживая влажное состояние добавлением красителя по мере испарения. Выпаривать можно и по-другому, помещая стекла на штатив, находящийся над емкостью с кипящей водой. Удаляют промокательную бумагу и обесцвечивают мазок смесью кислоты и спирта в течение 1 минуты. Высушивают тонкий, нанесенный на предметное стекло слой водного насыщенного раствора нигрозина и просматривают стекло в микроскоп раствор нигрозина готовят следующим образом: Пробирки опускают на 10 минут в кипящую водяную баню. Результаты получают те же, что указаны выше, но методика менее трудоемкая. Эндоспоры окрашиваются в ярко-зеленый цвет, а вегетативные клетки — в красно-коричневый. Сохраняют окрашенные бумажки в закрытых банках в защищенном от солнечного света месте. Препарат нагревают над пламенем до появления паров 3—4 раза , приблизительно в течение минуты. При испарении добавляется вода. Если необходимо, добавляют несколько капель воды. Через 30—40 секунд мазок промывают водой, высушивают и микроскопируют. Для окраски лучше брать малахитовую зелень в виде двойной соли ZnCl 2 медно-желтые кристаллы , хуже — щавелевокислая соль фиолетово-зеленые или ярко-зеленые кристаллы с бронзовым блеском. Промывают водой, высушивают через фильтровальную бумагу. Наиболее простой и демонстративный; он не требует химических протрав и дифференцировки. Приготовленный на предметном стекле мазок из исследуемой культуры фиксируют на пламени. Затем препарат промывают водой, высушивают через фильтровальную бумагу, фиксируют на пламени и окрашивают карболовым раствором фуксина при нагревании до появления паров в течение 3—5 минут. Краску смывают водой, мазок высушивают. Недостаток способа — значительный расход краски фуксина. Краситель желательно добавлять к остальным ингредиентам непосредственно перед использованием, конечный раствор отфильтровать. Обычные бактерии удобно выращивать на косячках агара с соответствующим содержанием питательных веществ. Точное время следует определить экспериментально. На мазок кладут кусочек промокательной бумаги и заливают на 3 минуты раствором Б. Жгутики и клетки бактерий окрашиваются в красный цвет. После охлаждения стекла используют немедленно или хранят в емкости, не содержащей пыли. Смешивают равные объемы растворов 1 и 2; затем два объема получившейся смеси приливают к одному объему раствора 3. В охлажденном виде полученная смесь хранится 1—2 мес. Восковым стеклографом очерчивают вокруг мазка прямоугольник. Оставляют краситель приблизительно на 7—15 минут; оптимальное время реакции следует определить экспериментально. Пленку высушивают на воздухе и смотрят в микроскоп. Тела и жгутики бактерий окрашиваются в красный цвет. Раствор аммиачного серебра III готовят по следующей методике: Хранить в темной склянке с притертой пробкой защищать от пыли! Перед окраской реактив разбавляется 1: Как правило, жгутики в старых культурах теряются. Иногда необходимы частые систематические пересевы в течение долгого времени на жидкие среды ежедневные пересевы на свежие среды , пока подвижность микробов не восстановится. Хорошей средой для пересевов является обыкновенный или кровяной агар, свежий, с влажной поверхностью. Рекомендуют готовить препарат только на новых, еще не бывших в употреблении, безукоризненно чистых предметных стеклах. Стекла обрабатывают для очистки концентрированной соляной кислотой в течение 15 минут; затем кислоту сливают, остатки ее нейтрализуют крепким аммиаком, стекла промывают дистиллированной водой и переносят в чистый винный спирт. Вынутые из спирта пинцетом! Отсюда маленькой петлей наносят 5—6 отдельных капель взвеси на центральную часть предметного стекла, не касаясь петлей его поверхности и не размазывая капли. Когда капли высохнут на воздухе, приступают к их окраске. На препарат используя пинцет Корнэ! Тщательно смывают протраву дистиллированной водой удалению протравы способствует протирание стекла вокруг мазка кусочком фильтровальной бумаги. Обрабатывают препарат в течение 2—2,5 минут раствором серебра при легком подогревании, пока на препарате не станут видны весьма слабо окрашенные в коричневый цвет округлые пятна рассматривать на белом фоне или в проходящем свете! Тщательно промывают мазок дистиллированной водой и высушивают на воздухе. Если жгутики не окрасились, удаляют масло с препарата ксилолом и вторично повторяют процедуру окраски, так как жгутики обнаруживаются только при особенно интенсивной окраске. В препарате могут быть осадки или грязный фон вследствие переноса на стекло частиц агара, конденсационной воды или при употреблении плохо очищенных стекол, грязного пинцета, наконец, в том случае, если была плохо отмыта протрава. Если бактериальная эмульсия слишком густа, то бактерии в мазке будут скучены и картина флагелляции вследствие беспорядочного сплетения жгутиков будет неясна. Желательно подобрать такую концентрацию, чтобы в одном поле зрения находилось от 5 до 10 отдельно расположенных бактерий с хорошо расправленными жгутиками. Заготовляемые для хранения препараты заключают в парафиновое масло или чистый канадский бальзам под покровным стеклом, иначе они быстро обесцветятся под действием света. Особенность данного способа окраски жгутиков — отсутствие в протраве танина. Для приготовления эмульсии в физиологический раствор, налитый в чистую пробирку в объеме 5 мл, осторожно погружают петлю со свежей культурой для получения слабой эмульсии. Легкими круговыми вращениями пробирки между ладонями эмульсию равномерно смешивают, затем добавляют в нее одну каплю формалина. Приготовленный препарат осторожно фиксируют на пламени горелки и обрабатывают при подогревании в течение 0,5—1 минуты протравой следующего состава: Препарат, приготовленный со всеми предосторожностями, подогревают до появления паров в течение 1—1,5 минут в леффлеровской протраве способ Леффлера см. Затем протраву смывают водой до прекращения отхождения краски и окрашивают мазок в растворе Мюра, предварительно смешанном и профильтрованном см. Препарат после окраски промывают водой. Бактерии окрашиваются в темно-фиолетовый, а жгутики — в бледно-фиолетовый, красноватый цвет. Раствор сернокислого цинка 1г , 15г танина, мл дистиллированной воды;. Обычно не во всех точках препарат одинаково хорошо и равномерно окрашивается. Для выявления цитоплазматических включений в бактериях используют следующий метод:. Несколько раз погружают и промывают предметное стекло в ксилоле, а затем подсушивают впитывающим ксилол материалом. Промывают предметное стекло водопроводной водой, подсушивают и смотрят в микроскоп. Мазок на предметном стекле фиксируют нагреванием. Толуидиновый синий окрашивает метахроматически, и гранулы имеют красный цвет на фоне голубой цитоплазмы. Восстанавливающий раствор готовят следующим образом: Добавляют к фильтрату 10 мл 2Н соляной кислоты и 4 г метабисульфита калия. Сосуд плотно закупоривают и оставляют на 12 ч в холодном темном месте. Реактив Шиффа хранят в темноте. Полисахариды окрашиваются в красный цвет, все остальные компоненты цитоплазмы — в зеленый. Окрашивают мазок в течение 1 минуты разведенным в 9 раз в воде альциановым синим, приготовленным так, как описано выше. Полисахариды окрашиваются в голубой цвет, а другие составляющие цитоплазму компоненты — в красный. Выбор питательной среды зависит в значительной степени от цели эксперимента. Однако следует признать, что они обладают рядом практических неудобств. Микроорганизмы, выращенные на таких питательных средах, обычно фенотипически отличаются от выращенных на питательных средах естественного происхождения типа бульона например, по составу и по скорости деления. Размножение микроорганизмов на таких средах обычно легче подавляется избыточной аэрацией или токсическими катионами; они также более чувствительны к нарушениям баланса между некоторыми составными частями питательной среды, особенно аминокислотами. Многие бактерии нуждаются в большом числе факторов роста, и для некоторых из них до сих пор не найдены искусственные среды, на которых они могли бы размножаться. Все перечисленные элементы должны находиться в питательной среде в удобоусвояемом для данного микроорганизма соединении, причем требования различных микробов в этом отношении неодинаковы. Источником углерода для патогенных бактерий являются, главным образом, различные углеводы: Питательные вещества могут усваиваться микробами только при определенной реакции питательной среды, так как проницаемость оболочек микробных клеток изменяется в зависимости от рН среды. Плотные питательные среды готовят из жидких посредством прибавления к ним клеевых веществ - агара или желатина. Однако при рН ниже 6,3 и выше 7,0 плотность желатина уменьшается, и он плохо застывает. Для приготовления питательных сред используют:. Продукты растительного происхождения картофель и др. Содержать необходимые для питания микроба питательные вещества. Иметь реакцию рН, оптимальную для выращиваемого вида микроба. Питательные среды подразделяются на среды общего назначения и специальные. Определенный состав и концентрация питательных микроэлементов, ростовых факторов при строгом значении рН обеспечивают оптимальные условия для выращивания одного или нескольких видов микроорганизмов. Среды с углеводами и многоатомными спиртами для обнаружения соответствующих ферментов. Среды для определения редуцирующей способности микробов. Приготовление питательных сред — один из наиболее ответственных и трудных участков работы бактериологической лаборатории. В связи с этим биопромышленность выпускает стандартные, консервированные, сухие питательные среды, различного назначения, для культивирования микроорганизмов. Приготовление обычных питательных сред. Основой для приготовления этих сред служит мясная вода, содержащая экстрактивные вещества. Питательные среды готовят в кастрюлях, эмалированных или из нержавеющей стали. Готовые питательные среды разливают во флаконы, пробирки, чашки. Посуду, бывшую в употреблении, стерилизуют, затем моют, прополаскивают и сушат. Сухие флаконы, колбы, пробирки закрывают ватно-марлевыми пробками. Оставляют на сутки в прохладном месте или помещают на 2 часа в термостат. Мясную пасту отжимают через марлю, кипятят в течение 5 минут. Для свертывания белков дают остыть. Фильтруют через ватный фильтр, доливают водой до первоначального объема. Она имеет вид прозрачной желтоватой жидкости слабокислой реакции рН 6,2—6,4 , без белков. Сушат пептон в распылительной вакуум-сушилке. Свиные желудки не промытые водой с обильным слизистым слоем очищают от пленок, жира и пропускают через мясорубку. К фаршу прибавляют воду и соляную кислоту в следующем соотношении: Затем смесь снова подщелачивают до рН 8 и разливают ее в бутыль. Для приготовления бульона к 1 части перевара прибавляют 6—7 частей воды. Концентрированный мясо-пептонный бульон готовят на особой мясной воде 1 кг мяса заливают 1 л воды. Он является веществом полисахаридной природы, содержит незначительное количество азота и не представляет собой питательный субстрат. Кипятят, помешивая, до полного расплавления агара. Свернувшиеся хлопья белка адсорбируют взвешенные частицы и осаждаются на дно. Проверяют и исправляют реакцию среды. Из расплавленного стерильного мясо-пептонного агара приготовляют скошенный и прямой агар агар столбиком. В первом случае пробирки укладывают горизонтально до полного застывания, во втором — пробирки помещают в штатив вертикально. Определяют pH с использованием pH-метров или менее точно с помощью индикаторной бумаги. Следует учитывать, что после стерилизации среда становится более кислой. Однако первым этапом этой методики является посев или пересев бактериальной культуры на различные типы питательной среды. Жидкий материал для посева берут петлей или пипеткой. Схема пересева культуры микробов из пробирки в пробирку. Все манипуляции, связанные с посевом и выделением микробных культур, производят над пламенем горелки. Пипетки и шпатели, используемые для посевов, так же, как и бактериальные петли, перед посевом прожигают, а после посевов опускают в дезинфицирующий раствор. Жидкий материал, набираемый в пастеровскую или градуированную пипетку, вливают в питательную среду. Петлю держат, как писчее перо. Петлю с находящимся на ней пересеваемым материалом вводят в пробирку до дна, опускают плашмя на поверхность питательной среды и скользящими движениями наносят штрих снизу вверх, от одной стенки пробирки к другой рис. При посеве на поверхность плотной питательной среды в чашки Петри чашку держат в левой руке. Дно ее с одной стороны придерживают I и II пальцами, а с другой — IV и V пальцами. Небольшое количество исследуемого материала втирают бактериальной петлей в поверхность питательной среды у края чашки рис. Нужно стараться, чтобы штрихи, наносимые петлей, располагались как можно ближе друг к другу, так как это удлиняет общую линию посева и дает возможность получить изолированные колонии микроорганизмов. Посев на плотную питательную среду в чашки Петри. При обилии в засеваемом материале микробов они растут в виде пленки, покрывающей всю поверхность питательной среды. Такой характер микробного роста получил название сплошного, или газонного. Посев газоном производят, когда нужно получить большие количества микробной культуры одного вида. Набирают 0,1—1 мл взвеси в пипетку в зависимости от степени предполагаемого микробного загрязнения и выливают в пустую стерильную чашку Петри. Посев уколом в столбик питательной среды производят в пробирку со средой, застывшей в виде столбика. Чистой культурой микробов называют популяцию микроорганизмов одного вида, полученную из изолированной микробной колонии. Для выделения чистых культур микробов из материалов, содержащих обильную смешанную микрофлору, предложено много различных методов. Если микроорганизмы образуют слизь, то к ней часто прикрепляются посторонние формы. Из чистой культуры обычно вырастают одинаковые колонии и при микроскопировании выявляются похожие клетки, в частности, по размеру и окраске по Граму. Кроме того, в чистых культурах различных микроорганизмов могут появиться кокковидные клетки, цисты и споры. Для маркировки на обратной стороне чашки Петри карандашом наносят букву Т, разделяющую дно на 3 сектора. Три пробирки, содержащие по 15 мл мясо-пептонного агара, ставят в водяную баню для расплавления агара. Для лучшего перемешивания материала со средой засеянную пробирку вращают несколько раз, зажав между ладонями. После этого прокаленной и остуженной петлей содержимое 1-й пробирки переносят во 2-ю и таким же образом из 2-й в 3-ю. После застудневания среды с исследуемым материалом чашки помещают в термостат. Расплавленную питательную среду разливают в три чашки Петри. При посеве материала стараются получить изолированный рост колоний. Колонии характеризуют по величине, форме, контуру края, рельефу, поверхности, цвету, структуре и консистенции. Величина колонии определяется ее диаметром. Характер контура края определяют при рассмотрении колонии под лупой или микроскопом с малым увеличением. Такой край колонии называется расплывчатым. Рельеф колонии характеризуется приподнятостью ее над поверхностью питательной среды и контуром формы в вертикальном разрезе. Поверхность колонии изучают с помощью лупы или под микроскопом при малом увеличении. Среди шероховатых форм колоний различают: Преобладающее большинство патогенных бактерий пигмента не образуют, вследствие чего колонии их бесцветны или молочно-мутного цвета, похожи на опал. В проходящем свете такие колонии в большей или меньшей степени прозрачны. Колонии бывают однородные и неоднородные. Строение первых одинаково во всех частях, у вторых центральная часть отличается от периферической или отдельные сектора имеют строение, неодинаковое с остальной массой. По характеру консистенции колонии бывают:. Осадок может быть скудным или обильным, крошковидным, гомогенным, волокнистым или в виде крупных рыхлых хлопьев, по консистенции вязким, слизистым, хрупким или пастообразным. Питательная среда над осадком может быть прозрачной или мутной. Цвет осадка и среды, находящейся над ним, определяется наличием пигмента, продуцируемого культурой микробов. Придонный рост специфичен для бактерий с анаэробным типом дыхания. Пристеночный рост бактерий выражается в том, что питательная среда, находящаяся в пробирке, остается совершенно прозрачной. Рост бактерий в виде поверхностной пленки характерен для микробов-аэрофилов. Посев, произведенный таким образом, дает возможность выявить подвижные расы микробов и дифференцировать их от неподвижных. По характеру связи с цитоплазменными структурами и по месту проявления своего действия ферменты делятся на внутри- и внеклеточные. Под действием сахаролитических ферментов бактерий сахара расщепляются на альдегиды и кислоты. Характерно, что различные виды и даже разновидности микробов относятся по-разному к одним и тем же сахарам. Пробирки с набором сред Гисса ставят в штатив в один ряд. Культуру берут на кончик петли в очень небольшом количестве и засевают по общепринятой методике. Протеолитическая активность одного и того же микроба при определении ее на разных питательных средах будет проявляться неодинаково, что обусловлено специфичностью ферментов. Мясо-пептонный желатин разливают в пробирки столбиком по 5— 6 мл. Пробирки, в которых после суточного инкубирования среда остается без изменения, оставляют в термостате. Молочный агар Эйкмана, разлитый и остуженный в чашках Петри, засевают исследуемой культурой микробов. Через 24—48 ч инкубации в термостате культуры, продуцирующие протеолитический фермент, обусловливают пептонизацию молочного белка — казеина, в результате чего вокруг таких колоний образуются прозрачные зоны, четко выделяющиеся на общем молочно-мутном фоне среды. В пробирку с мясо-пептонным бульоном или бульоном Хоттингера, содержащим кусочек свернутого куриного белка, вносят одну петлю исследуемой культуры микроба. Посевы просматривают ежедневно в течение 5 дней. Аналогичным образом проявляются протеолитические свойства микробов в средах с кусочком вареного мяса. Индол образуется при расщеплении сложной гетероциклической аминокислоты — триптофана. Для выявления индолообразования петлю исследуемой культуры засевают в среду Строгова или другие среды, рекомендуемые для обнаружения индола. Для этого верхнюю треть бумажной полоски прижимают пробкой к стенке пробирки. Образование индола определяют по окрашиванию нижнего конца индикаторной бумаги в бледно-розовый цвет, хорошо заметный в проходящем свете. В положительных случаях образующийся в культуре сероводород вступает в соединение с бесцветным ацетатом свинца и превращается в сульфид свинца, который придает индикаторной бумаге черно-бурое окрашивание. Первое вещество, от которого отщепляется водород, называют донатором, а то вещество, к которому он присоединяется, — акцептором. С целью выявления ферментов дегидрогеназ и определения их активности в практике микробиологических исследований предложен метод, основанный на введении в питательную среду органической краски, выполняющей роль акцептора водорода. В результате присоединения водорода краситель восстанавливается, превращаясь в бесцветное соединение, называемое лейкобазой. При обильном доступе кислорода оно может вновь окислиться и приобрести прежний цвет. В качестве акцептора водорода используют метиленовый синий, лакмусовую настойку, малахитовый зеленый, индигокармин, нейтральный красный и др. Один и тот же вид микроба ведет себя неодинаково по отношению к краскам разного состава. В 5 мл среды—молока с метиленовым синим— засевают петлю исследуемой культуры с плотной питательной среды или 0,1 мл часовой бульонной культуры и после 24 ч инкубации учитывают результаты роста. Образование кислоты обозначается буквой К, щелочи — буквой Щ. При определении чувствительности желательно иметь чистые культуры возбудителя и лишь при необходимости срочного получения ответа используют смешанные культуры, содержащие всю микрофлору, имевшуюся в исследуемом материале. На поверхности засеянного агара пинцетом раскладывают диски с антибиотиками — по 5—6 дисков на каждую чашку на расстоянии 25 мм от центра чашки. Однако этот метод нельзя считать количественным. Бульон Хоттингера или другую среду, пригодную для роста данного микроорганизма разливают по 2 мл в пробирки, расставленные в штативы, по 10 в каждом ряду. Готовят раствор антибиотика, содержащий ЕД в 1 мл, и добавляют 2 мл этого раствора в первую пробирку. Из этого расчета и следует разводить антибиотик. Из этого основного раствора делают дальнейшие разведения по указанной выше схеме. Таким образом, во всех пробирках содержится в 1 мл микроорганизмов. Перпендикулярно к канавке засевают штрихом изучаемые культуры микроорганизмов. Чаще всего в повседневной практике применяют для этой цели мелких, наиболее дешевых, животных: Широкое применение находят лабораторные животные и в серологической практике: Кроме того, лабораторные животные широко используются при определении качеств биологических и химиотерапевтических препаратов, а также научно-экспериментальной работе. Бактериологические лаборатории для повседневной работы обычно разводят лабораторных животных в специально организованных для этой цели питомниках. Это дает возможность всегда получать в достаточном количестве проверенный и безупречного качества подопытный материал. Если животные не разводятся, а только содержатся в лаборатории, то помещение для них носит название — виварий. Новые партии животных закупаются в питомниках. Условия содержания и кормления в данных подразделения практически аналогичны, поэтому в ниже приведенном материале не будет дифференциации между указанными структурами лаборатории. Содержание животных в питомниках должно по возможности соответствовать условиям существования их в природе. Это положение особенно относится к диким, родившимся на воле животным и птицам дикие голуби, воробьи, домашние серые мыши и крысы. Обязательным условием успешной работы питомника является строгое соблюдение всех ветеринарно-санитарных, зоотехнических и зоогигиенических правил. Питомник виварий должен иметь несколько отделений для содержания различных видов животных кролики, морские свинки, мыши и т. В структуру вивария входят:. Оборудование экспериментального помещения определяется в каждом конкретном случае задачами и условиями проводимых научных исследований. Работа дезинфекционно-моечного отделения определяется состоянием материала, поступающего на обработку. Журнал регистрации поступления и распределения лабораторных животных в экспериментально-биологической клинике виварии. По этим же соображениям запрещается выносить из карантинного отделения в другие помещения вивария корма, спецодежду и инвентарь. Методы дезинфекции в каждом конкретном случае определяются соответственно специфике работы учреждения. В этих случаях опыты на животных временно прекращаются. Грызуны содержатся в клетках со сплошным дном на подстилке или с сетчатым дном-полом. Стеллажи размещаются в основном вдоль стен и должны занимать примерно 0,4 м производственной площади. В каждом отдельном помещении вивария рекомендуется содержать только один вид животных. Нормы площади для содержания лабораторных животных. Минимальная площадь дна клетки на одно животное, см 2. Клетка N o ,.. Трупы животных, погибших в ходе эксперимента, до вскрытия хранятся в специальном холодильнике не более суток. В случае гибели животного вне зависимости от опыта на вскрытии присутствует представитель вивария. Журнал регистрации павших или вынужденно забитых животных. После вскрытия трупы заразных животных сжигают под. Работа по уходу и содержанию лабораторных животных строится в соответствии с распорядком дня и регламентом работы, утвержденным руководителем учреждения. Переднюю стенку клетки обивают металлической сеткой с диаметром ячеек в 2—3 см. Стенки такой клетки—переднюю дверка , одну боковую, верхнюю и дно—обтягивают мелкой сеткой. При очистке клетку поднимают, и все нечистоты через сетку попадают в противень. Клетки располагают на стеллажах, рядами, в один или 2—3 яруса, на расстоянии 40—50 см от пола и стен в целях защиты животных от диких грызунов крыс, хорьков. Клетки нужно регулярно, не реже одного раза в три дня, очищать и мыть горячей водой. После такой обработки клетки высушивают огнем паяльной лампы, а в летнее время—на солнце. В сырые клетки помещать животных нельзя. Нечистоты из питомника следует удалять немедленно после уборки в специально определенное для этой цели место. Некоторые общие сведения о лабораторных животных мы приводим в виде таблицы. Общие сведения о лабораторных животных. То же, самцов от самок в месяцах. Предел производительности самцов в годах. Пол каждой клетки чистят веником и металлическим скребком. После чистки каждой клетки скребок обеззараживают, погружая его на несколько минут в банку с дезинфицирующим раствором. Вынутые из клеток кормушки и поилки моют горячей водой с зольным щелоком или содой, а затем обдают кипятком. Очистив клетки, служитель вивария приступает к уборке помещения вивария: Для поддержания чистоты и предупреждения заноса инфекции у входа в каждую комнату вивария кладут плотную мешковину, натянутую на лист железа. Чистка, дезинфекция, мойка клеток, кормушек и поилок производятся рабочими, специально закрепленными за дезинфекционно-моечным отделением. По окончании уборки весь собранный в виварии мусор кал, остатки пищи, опилки, сено, солома и т. При работе с инфицированным материалом производится обязательное обеззараживание отходов автоклавированием или обработкой дезинфицирующими веществами. Каждый работник обеспечивается персональной спец. Для каждого сотрудника должен быть индивидуальный шкаф с двумя отделениями. Одно из них предназначается для хранения в течение рабочего дня домашней одежды и обуви, которые работник вивария обязан снимать, приходя на работу; в другом отделении во внерабочее время находится спецодежда. По окончании работы персонал вивария обязан пройти обработку в санитарном блоке принять душ или ванну. В кормовой рацион нужно вводить все необходимые для животного организма вещества белки, углеводы, жиры минеральные вещества, витамины и вода. Из концентратов кролики и морские свинки получают пшено, овес, пшеницу, ячмень, горох, чечевицу, вику кукурузу. Желательно давать в суточной норме животным смесь семян нескольких 2—3 культур. Незаменимым кормом для кроликов и свинок в летнее время является свежая трава и овощная зелень, а зимой—проращенное зерно. Белым мышам и крысам дают овес, пшеницу, пшено, ячмень, льняное, конопляное, подсолнечное семя. Во избежание ожирения животных семена масличных культур вводят в рацион в небольших количествах. В корм идут также пшеничный хлеб кислый ржаной хлеб может вызвать поносы , сухари, каши овсяная, перловая, пшенная , молодняку—манная каша на молоке. Кроме того, в рацион входят морковь, яблоки—антоновка последние особенно необходимы при желудочно-кишечных заболеваниях и зеленые корма салат, шпинат, морковная ботва. Ковалевский рекомендует вводить в рацион крысам вареную свеклу и картофельное пюре. Кроме того, ежедневно все животные должны получать поваренную соль: В каждую клетку для мышей и крыс кладут кусок 1 —5 г мела из расчета на 3—4 дня. Суточная норма рыбьего жира: В качестве подстилки для кроликов применяют солому, торф; для мышей и крыс— мелкое сено. Кормят и поят животных два раза, а кормящих самок—три раза в сутки, в точно установленное время. Кормушки лучше всего глиняные из обожженной глины , достаточного веса во избежание перевертывания их животными и удобные для чистки мойки. Кормушки ежедневно очищают и моют горячей водой. В каждой клетке должно быть по две кормушки: Корма задают только свежие. Заболевают кролики, морские свинки, мыши и крысы. Свинки болеют чаще в острой форме, а остальные виды — преимущественно в подострой или хронической форме. Клиника при острой форме: Смерть обычно через 12—48 часов. При подострой и хронической форме: Болезнь затягивается до двух и более недель. Диагноз подтверждается бактериологическим исследованием. Паратиф поражает чаще всего крыс и мышей, но возможна передача инфекции морским свинкам и кроликам. Заболевание протекает в виде септицемии острая форма с клиникой поноса фекальные массы желтовато-зеленоватого цвета , отказа от корма и общего угнетения. Смерть наступает обычно через 24—48 часов. При хроническом течении клинические признаки выражены неясно: Диагноз устанавливают бактериологическим исследованием. Заболевают крысы, мыши, реже кролики и морские свинки. Для постановки диагноза необходимо бактериологическое исследование. Больных животных немедленно убивают. Инфекционная пневмония чаще всего поражает морских свинок. При постановке диагноза следует иметь в виду также пневмонии инвазионного и грибкового происхождения. Чаще заболевают кролики и морские свинки. Продолжительность заболевания от нескольких дней до 5—6 недель; смерть от истощения. Увеличение лимфатических узлов, преимущественно, брюшной полости. Чаще всего поражаются кролики. Различают кишечную, печеночную и смешанную формы. Заболевание протекает остро и хронически последнее чаще у взрослых кроликов, острое — у молодняка. При вскрытии — катар слизистой кишечника или наличие в печени белых узелков величиной от булавочной головки до горошины. Диагноз — на основании микроскопического обнаружения ооцист кокцидий. Меры борьбы и профилактика: Перед опытом животное клеймят, взвешивают, определяют, если нужно, его пол, возраст и измеряют температуру тела. Клеймение кроликов и морских свинок производят при помощи готовых металлических бирок с номерами или наложением тавра татуировочными щипцами. Номерки можно приготовить своими силами из нарезанных кусочков мягкой жести. Пишут на металле заостренной палочкой и тотчас же надпись высушивают фильтровальной бумагой. Перед клеймением татуировочными щипцами ухо внутренней стороны протирают спиртом, накалывают щипцами соответствующий номер, а затем место прокола втирают тушь или спиртовой раствор копоти. В крайних случаях, при острых опытах, можно метить животных путем выстригания шерсти на различных участках тела. У подопытных животных окрашивают разные части тела. Сочетание двух различных красок позволяет пометить до животных. Ниже в качестве примера приводится одна из схем нумерации. Метки пикриновой кислоты соответствуют единицам, метки фуксином обозначают десятки. При комбинации двух красок может быть получен любой двузначный номер, например: У птиц металлические номера браслеты надевают на одну из ножек. Взвешивание животных производят, смотря по их величине, или в ящике на обычных столовых весах Беранже , или на весах для взвешивания новорожденных детей по Метелкину. Мелких животных, например, мышей, взвешивают на ручных аптекарских весах с роговыми чашками. Для определения пола у кроликов захватывают их левой рукой за кожу в области шеи вместе с ушами, а другой рукой, оттянув хвост, натягивают свободными пальцами кожу у полового отверстия: Таким же образом определяют пол у морских свинок. Измерение температуры тела у лабораторных животных производится обычным максимальным термометром перед постановкой опыта, а иногда и во время нахождения животного под опытом. Нормальной глубиной для введения термометра принято считать 3,5 см. Измерение температуры тела у животного следует производить постоянно в одни и те же часы, одним термометром, вводя его на одну и ту же глубину. Термометр перед введением в прямую кишку дезинфицируется спиртом, вытирается досуха, а затем смазывается вводимый его конец вазелином. Пальцем другой руки производят поглаживание несколько раз по шерсти от шеи до симфиза. Спустя несколько секунд морская свинка остается лежать совершенно неподвижно. Термометр вводят в прямую кишку сначала почти вертикально, а затем параллельно линией оси тела животного. Замечают время и следят за столбиком ртути. Кроликов помещают на колени, охватывают левой рукой с упором головы животного в локтевой сгиб и той же рукой захватывают и поднимают хвост; правой рукой вводят термометр. Показатели нормальной температуры у лабораторных животных приведены выше, в таблице. Подготовка материала и инструментов для заражения. Материалом для заражения лабораторных животных в повседневной практике диагностических лабораторий обычно служат эмульсии, приготовленные из различных органов и тканей присланного для исследования материала. Кроме того, материалом для заражения могут быть различные истечения, мокрота, кровь, отделения ран, язв и т. Эмульсии из органов тканей обычно готовятся на физиологическом растворе, примерно в соотношении 1: Для этой цели берутся небольшие кусочки из наиболее пораженных участков и растираются с физиологическим раствором в стерильной ступке до получения равномерной взвеси. При наличии трудно растираемого материала добавляют прокаленный песок, и после получения эмульсии фильтруют ее через марлю. Бактериальную культуру готовят для заражения согласно схеме опыта или инструкции по выделению определенного микроорганизма, что указано в схеме по диагностике диагностики инфекционной болезни. На этикетках для клеток банок указывается фамилия ответственного за данный опыт сотрудника, дата, количество и вид животных, чем привиты, метод прививки и вводимая доза. Подготовка шприцов к заражению. Для обеспечения безопасности при заражении животных разработаны специальные методические приёмы, включающие в себя:. Шприцы должны отвечать следующим требованиям: При сборке шприца после проверки иглы на проходимость, определяют притёртость иглы к канюле цилиндра — шприц насухо вытирают стерильным ватным тампоном, наполняют через иглу водой из стерилизатора, воду под большим давлением выпускают и проверяют место насадки иглы — отсутствие капель в этом месте свидетельствует о правильной сборке шприца, плотной притёртости иглы к канюле и пригодности его к работе с инфекционным материалом. Наполнение шприца инфекционным материалом проводят над ёмкостью с дезраствором. При наполнении шприца следует избегать попадания в него пузырьков воздуха. Пузырьки воздуха из шприца с инфекционным материалом удалять категорически запрещается. Вводить животным материал с пузырьками воздуха не рекомендуется, так как это может повлечь за собой образование капель при извлечение иглы после заражения. В этом случае инфекционный материал следует выпустить в тампон, погружённый в дезраствор, шприц разобрать и поместить в ёмкость для кипячения. Для дальнейшего заражения использовать запасной шприц. Шприц с инфекционным материалом следует держать над ёмкостью с дез. Разборка шприцов после заражения проводится над ёмкостью, предназначенной для кипячения последних. Для предотвращения разбрызгивания при разборке шприц должен быть опущен в ёмкость иглой вниз. Осторожно пинцетом последовательно снимается и опускается игла, поршень и цилиндр. Пинцет после разборки опускают в стакан со спиртом. При наличии в шприце остатков инфекционного материала его перед разборкой шприца выпускают в тампон, погружённый в дез. Иглы после кипячения необходимо тщательно продуть, затем вставить мандрен, т. Исключение составляет только заражение кроликов в мозг или под твердую мозговую оболочку, когда необходим фиксирующий столик. Кроликов помещают на стол в левом боковом положении, головой вправо от оператора. Приподняв заднюю часть животного и, освобождая правую руку, подводят ее ладонью вверх под грудную клетку позади передних конечностей. После этого кролика снимают со стола и вытягивают во всю длину. Для этого удобно пользоваться боксом рис. Передняя стенка ящика состоит из двух частей: Через это отверстие выводят наружу и фиксируют голову кролика. Бокс для фиксации головы кролика. Выдвигают верхнюю крышку бокса и вынимают верхнюю половину передней стенки. На ребрах боковых сторон доски имеется по 2 крючка или петли. Он представляет собой надеваемое на голову животного кольцо, соединенное со штативом. При помощи винтов высоту кольца на стойке штатива можно регулировать. Все 4 лапы продевают в петли, сделанные из бинта, которые затем плотно затягивают. Фиксацию животного к станку производят с помощником. Фиксация морской свинки руками. Морскую свинку брюшком кверху или наружу рис. Правой рукой свинку поглаживают по животу до тех пор, пока она не успокоится, и только после этого приступают к намеченной операции, придерживая задние лапы животного правой рукой. Работать с мышами можно и без помощника, фиксируя их левой рукой: При перечисленных способах, за исключением перорального и интраназального, заражение осуществляется с помощью шприца. Повернув шприц иглой кверху, осторожно выпускают из него пузырьки воздуха. Загрязненную вату бросают в банку с дезинфицирующим раствором. Для наркоза чаще всего применяют эфир или хлороформ. Наркоз наступает обычно через 45—60 минут. Несомненно, существуют и более современные схемы и препараты для обезболивания и наркоза лабораторных животных. Материал внутрикожно вводят в небольших количествах 0,1— 0,2 мл. Материал 1—2 капли втирают стеклянной палочкой или шпателем в недоступных слизыванию местах. Выбирают участок тела с наиболее развитым мышечным слоем. Захватывают I и II пальцами левой руки толстую мышечную складку и вводят иглу почти под прямым углом в глубь мышц. Помощник держит животное вниз головой. Преодолевая сопротивление, очень осторожно, буравящими движениями иглу продвигают вглубь. Кроликов заражают в краевую вену уха. Но многократное применение ксилола не рекомендуется ввиду сильного раздражения кожи. После обработки кожи ксилолом его необходимо снять с поверхности. После явного набухания вены под ухо подводят II палец левой руки. Прокол вены следует делать ближе к верхушке уха, так как при частых уколах возможна облитерация сосуда в этом месте, но проксимальный участок вены остается неповрежденным. При нахождении иглы в полости вены материал вводится свободно, в противном же случае жидкость из шприца вытекает с трудом, а на ухе в месте введения образуется вздутие. Крыс и мышей заражают в боковую вену хвоста. При введении иглы в вену шприц держат под острым углом, почти параллельно оси хвоста. Корень хвоста освобождают от сдавливания. Как и в предыдущем случае, нахождение иглы в вене определяют по легкости введения материала и отсутствию заметного уплотнения в месте, где находится игла. Поэтому значительно чаще материал, предназначенный для заражения, вводят животному шприцем, игла которого имеет незначительный изгиб и утолщение на конце в виде оливы. Наличие изгиба допускает введение иглы в пищевод животного. Иглу, введенную в рот, продвигают по задней стенке глотки на глубину 1 см у мышей и 2—2,5 см у крыс. Процесс введения иглы, как правило, затруднений не представляет, конец ее проникает непосредственно в желудок или нижний отдел пищевода. Удобнее всего завернуть их в полотенце и посадить к помощнику на колени. Заразный материал вводят через эластический зонд. Для этой цели обычно выбирают катетер из наиболее мягкой и эластичной резины длиной 7,5—8 см и толщиной не более 0,3—0,5 см. Заражение через пищеварительный тракт. Для того чтобы облегчить введение зонда, животному вливают пипеткой в рот несколько капель воды, вызывая глотательные движения, во время которых зонд легко, без внешнего воздействия продвигается в глубь пищевода. Зараженный материал с помощью шприца вводят в нос небольшими каплями на глубину 1—1,5 мм мышам, 2—3 мм крысам, 4 мм кроликам и морским свинкам. Чтобы не поранить слизистые оболочки, для введения материала берут абсолютно тупую иглу. Затем фиксируют глазное яблоко путем захватывания складки конъюнктивы кнаружи от верхнего края роговицы глазным пинцетом. Иглу тотчас же вынимают, а ранка закрывается сама по себе. При правильном введении иглы вытекания влаги из передней камеры быть не должно. Можно также после прокола роговицы продвинуть иглу в центральном направлении до тех пор, пока из просвета иглы не покажется жидкость. Выпустив несколько капель влаги передней камеры глаза, иглу соединяют со шприцем и вводят исследуемый материал не более 0,05 мл. Применяется чаще у кроликов, крыс и мышей. Техника введения материала кроликам та же, что и при тральном методе, только инъекция производится прямой иглой через твердую мозговую оболочку непосредственно в толщу мозгового вещества. Доза вводимого материала—0,,3 мл. При отсутствии инструментов для трепанации можно произвести заражение в мозг путем прокола черепа через кожу, иглой шприца, несколько сбоку от средней линии в области затылочного бугра. Применяют также после разреза кожи прокол черепа острой канцелярской кнопкой с последующим введением в отверстие иглы шприца. Место укола предварительно выстригают и обрабатывают йодной настойкой. У белых мышей и крыс техника внутримозгового введения следующие: Прокол производят через кожу в область темени, латеральне средней линии; место укола предварительно обрабатывают настойкой йода. Обычно она прощупывается в третьем межреберье. Поршень шприца легко выдвигается наружу и в цилиндре его тотчас появляется кровь. Пункцией сердца можно получить у кролика 25—30 мл крови. Пункция сердца у морских свинок. У морских свинок можно получить таким образом 10—12 мл крови. Пункция сердца у крыс. Как и в предыдущих случаях, пальпаторно определяют место сердечного толчка. Одномоментно у крыс можно получить 6—8 мл крови. Вскрывают одну из сонных артерий, расположенных по обеим сторонам трахеи. Подготовленного для кровопускания кролика привязывают станку брюшком кверху, фиксируя голову кольцом к штативу. После того как наступит состояние наркоза, скальпелем делают разрез по средней линии шеи и разводят края раны пинцетом. Сверху артерия прикрыта грудино-подъязычной и грудино-щитовидной мышцами. Поэтому для обнаружения нервно-сосудистого пучка эти мышцы разделяют тупым концом скальпеля или браншами пинцета. Артерию освобождают от окружающей соединительной ткани и подводят под нее две лигатуры. Кончик вставленной канюли укрепляют второй лигатурой. Взятие крови из вены уха кролика. Если в результате всех перечисленных процедур сосуды не инъецируются, ухо смазывают ксилолом или толуолом. Для получения небольшого количества крови менее 1 мл прокалывают одну из небольших периферических ветвей, а для получения больших объемов крови 5—10 мл вскрывают краевую вену уха. При таком способе прокола из уха кролика получают до 30 мл крови. После взятия крови к проколу вены прикладывают на 2—3 минуты кусочек сухой стерильной ваты, не нажимая сильно на стенку сосуда, так как при этом кровотечение может усилиться. Взятие крови из вен у морских свинок, крыс и мышей. Взяв кровь, рану прижигают перекисью водорода. Животное берут I и II пальцами левой руки со стороны спины за шею и слегка сдавливают с боков, вызывая легкое выпячивание глаз. Фильтрат наливают в центрифужные пробирки и центрифугируют при — об. Эритроциты оседают на дно пробирки, а прозрачная, слегка желтоватого цвета плазма образует надосадочный слой. Во время свертывания сгусток крови обычно прилипает к стенкам пробирки. При отсасывании кончик пипетки не должен соприкасаться со сгустком крови, чтобы в сыворотку не попали эритроциты. Окрашенную в розовый цвет сыворотку центрифугируют при — об. Затем этот сгусток удаляют. В некоторых случаях фибрин из плазмы выпадает не полностью. Цитратная кровь не свертывается. В результате над осадком эритроцитов образуется прозрачный слой жидкости желтоватого цвета—плазмы. В лабораторной практике приняты способы умерщвления, которые характеризуются простотой приемов и вызывают быструю, безболезненную смерть животного. Кроликов умерщвляют посредством воздушной эмболии. Для этого в краевую вену уха по направлению к его основанию вводят иглу шприца. Появление капельки крови свидетельствует о том, что игла находится в вене. При надавливании на поршень в кровеносную систему животного поступает находящийся в цилиндре шприца дух, вызывая эмболию и быструю смерть. На уровне передних и задних лап делают боковые надрезы. Кожные лоскуты отпрепаровывают от подкожной клетчатки и отворачивают в стороны, прикалывая булавками к доске. В протоколе вскрытия отмечают состояние подкожной клетчатки и лимфатических узлов в паху и подмышечных впадинах. Подкожная клетчатка может быть развита сильно, слабо или умеренно. При осмотре узлов обращают внимание на их величину, форму и цвет. Если в грудной полости есть экссудат, из него делают мазки и посев. Вновь сменив ножницы или протерев их ватой, смоченной спиртом, разрезают перикард, обнажая поверхность сердца. Передний листок брюшины вскрывают ножницами. Таким же образом для посева берут экссудат, содержимое абсцессов, желчного и мочевого пузыря. Из паренхиматозных органов печень, почки, селезенка взятие материала и засев его производят одним из следующих способов. Изменения, обнаруженные при вскрытии животного в месте введения заразного материала, состояние подкожной клетчатки, лимфатических узлов; изменения, найденные во внутренних органах. Вид микроба, выделенного из трупного материала, его основные морфологические, культуральные, биохимические и серологические свойства. Для определения вирулентности микробных культур чаще всего используют белых мышей. Культуру микроба для заражения выращивают на мясо-пептонном агаре или другой плотной питательной среде, так как бульон, представляя собой сложный белковый субстрат, небезразличен для животного организма и может извращать результаты опыта. Для определения минимальной летальной дозы из бульонной культуры готовят ряд последовательных десятикратных разведений: Отстандартизованную взвесь микробов в изотоническом растворе хлорида натрия, а также разведения бульонной культуры готовят с таким расчетом, чтобы различные дозы микроба, используемые в опыте, содержались в одинаковых объемах жидкости. Каждую дозу культуры вводят одновременно нескольким животным. Степень вирулентности чаще всего характеризуют тремя следующими показателями:. В отличие от D l m и D l l , определявшихся непосредственно по результатам опыта, LD 50 вычисляется путем довольно сложных математических расчетов. Продуцируемые в процессе жизнедеятельности микроба экзотоксины легко диффундируют из клетки в окружающую их питательную среду. Получаемый при этом прозрачный фильтрат содержит неразведенный токсин. Токсигенность микробов определяют по тому же принципу, что и вирулентность. Для определения D l m и LD 50 фильтрат бульонной культуры разводят стерильным изотоническим раствором хлорида натрия в сотни, тысячи и миллионы раз. Например, дифтерийный токсин титруют на морских свинках, столбнячный токсин—на мышах. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. Микробиология с техникой микробиологических исследований. Методы общей бактериологии в 3-х т. Микробиологическая диагностика заболеваний сельскохозяйственных животных. Основы экспериментальной медицинской бактериологии. Помещение бактериологической лаборатории и оборудование рабочего места 6. Подготовка и стерилизация лабораторного оборудования Приготовление препаратов для микроскопии живых микроорганизмов Сложные дифференциальные методы окраски мазков Получение чистой культуры методом рассева в глубине среды по Коху Особенности микробного роста на жидких питательных средах Окислительно-восстановительные свойства микроорганизмов Краткие сведения о содержании, разведении, кормлении и заболеваниях лабораторных животных Фиксация, методы заражения и взятия крови у лабораторных животных Взятие крови у лабораторных животных и ее обработка Кафедра микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии Научно-методический центр пищевых инфекций. Введение 5 Бактериологическая лаборатория 5 Помещение бактериологической лаборатории и оборудование рабочего места 6 Правила работы и поведения в лаборатории 10 Уборка лабораторного помещения 11 Мытье и обработка лабораторной посуды 12 Дезинфекция 16 Стерилизация 17 Подготовка и стерилизация лабораторного оборудования 17 Виды стерилизации 19 Микроскопические методы исследования 24 Приготовление препаратов для микроскопии живых микроорганизмов 24 Приготовление мазков 29 Окраска мазков 31 Простые методы окраски мазков 34 Окраска по Муромцеву 34 Сложные дифференциальные методы окраски мазков 35 Окраска по Граму 35 Видоизменения метода окраски по Граму 37 Окраска по Граму в модификации Хукера. Методы частной бактериологии Учебно-методическое пособие Общие методы анализа Всемирная организация Дмитрий Аркадьевич Васильев, Анатолий Анисимович Щербаков, Лидия Владимировна Карпунина, Сергей Николаевич Золотухин, Инна Григорьевна Швиденко. Раствор А для приготовления красящего реактива: Раствор Б для приготовления красящего реактива: Реактив для флуоресцентной окраски: Родамин В, С1 Хлористая ртуть, насыщенный водный раствор. Карболовый фуксин, приготовленный по Цилю. Дмитрий Аркадьевич Васильев Анатолий Анисимович Щербаков Лидия Владимировна Карпунина Сергей Николаевич Золотухин Инна Григорьевна Швиденко.
Сколько по времени делается гастроскопия
Как сдавали на права отзывы
Яндекс музыка jah khalib лейла скачать
Методы стерилизации и дезинфекции в микробиологической лаборатории
Азер новости 2017 24 06
Как удалить логин на сайте
Sima land kz каталог
Бактериологическая лаборатория
Broiler ravvel wild eyes перевод
Золотая корона перевод денежных средств
Обработка помещений микробиологической лаборатории
Эвиналь крем от пигментных пятен
Москва схема найти
Сколько стоит мрт всего организма в москве
Shared Flashcard Set
Green day american idiot текст