1. Определение аминокислотного состава белка
Структурная организация белков.
Справочник химика 21
Традиционные методы выделения и очистки белков. Определение первичной структуры белков. Определение первичной структуры белков сводится к выяснению порядка расположения аминокислот в полипептидной цепочке. Эту задачу решают с помощью метода секвенирования от англ. Собственно секвенирование на его сегодняшнем уровне позволяет определить аминокислотную последовательность а полипептидах, размер которых не превышает несколько десятков аминокислотных остатков. В то же время исследуемые полипептидные фрагменты значительно короче тех природных белков, с которыми приходится иметь дело. Поэтому необходимо предварительное разрезание исходного полипептида на короткие фрагменты. После секвенирования полученных фрагментов их необходимо снова сшить в первоначальной последовательности. Таким образом определение первичной последовательности белка сводится к следующим основным этапам: Для специфического расщепления белков по определенным точкам применяются как ферментативные, так и химические методы. Из ферментов, катализирующих гидролиз белков по определенным точкам, наиболее широко используют трипсин и химотрипсин. Трипсин катализирует гидролиз пептидных связей, расположенных после остатков лизина и аргинина. Химотрипсин преимущественно расщепляет белки после остатков ароматических аминокислот - фенилаланина, тирозина и триптофана. При необходимости специфичность трипсина может быть повышена или изменена. Например, обработка цитраконовым ангидридом исследуемого белка приводит к ацилированию остатков лизина. В таком модифицированном белке расщепление будет проходить только по остаткам аргинина. Наряду с ферментативными методами используются и химические методы расщепления белков. Для этой цели часто применяют бромциан, расщепляющий белок по остаткам метионина: Секвенирование проводят методом, известным как метод Эдмана. Последовательная обработка полипептида, имеющего свободную концевую -аминогруппу, каким-либо алкил- или арилизотиоцианатом в слабощелочной среде приводит к образованию соответствующей тиомочевины, которая в умеренно кислой среде приводит при значениях кислотности, не повреждающих пептидной связи отщепляется в виде соответствующего тиогидантоина. Оригинальная процедура Эдмана основана на использовании фенилизотиоцианата и тем самым на образовании фенилтиогидантоинов: В результате образуется фенилтиогидантоин, содержащий боковой радикал аминокислоты R 1 , который может быть идентифицирован путем измерения какой-либо физической или физико-химической характеристики, позволяющей различать гидантоины, соответствующие разным входящим в состав белков аминокислотам. В качестве такой характеристики может служить хроматографическая подвижность в какой-либо предварительно проградуированной по стандартным образцам гидантоинов системе или молекулярная масса, определяемая с помощью масс-спектрометра. Превращение N-концевого аминокислотного остатка в тиогидантоин приводит к укорочению анализируемой полипептидной цепи на одно звено. Выделив этот пептид, исследователь получает возможность повторить всю процедуру, установить природу второго аминокислотного остатка и выделить полипептид, укороченный на два звена. Многократное повторение такой ступенчатой деградации дает возможность последовательно идентифицировать все составляющие исходный полипептид остатки аминокислот, то есть установить его первичную структуру. Практически метод Эдмана позволяет сделать один-два десятка шагов. Работа сводится к многократному повторению одних и тех же чередующихся процедур: Чтобы избавить исследователей от такой монотонной работы, требующей вместе с тем строгого соблюдения условий эксперимента на каждом шаге, созданы специальные автоматизированные установки для проведения всех перечисленных операций - автоматические секвенаторы полипептидов. С их помощью удается произвести до шагов ступенчатой деградации. Завершающим этапом установления первичной структуры белка является восстановление порядка, в котором просеквенированные фрагменты располагались в исходном полипептиде. Чаще всего для этой цели используют подход изветный как метод перекрывающихся белков. Ниже излагается основная идея метода. Если установлена структура всех полипептидов, полученных расщеплением исследуемого белка с помощью трипсина далее такие полипептиды обозначаются буквой Т от слова "трипсиновые" , то остается определить для каждого из этих пептидов, с какими двумя Т-пептидами он соседствует с N- и С-конца. В структуре просеквенированных Т-пептидов такая информация полностью отсутствует. Однако ее можно частично, а в ряде случаев и полностью восстановить, если располагать аналогичными данными для серии полипептидов, полученных расщеплением того же исследуемого белка по какой-либо другой группе аминокислотных остатков. Для определенности ниже речь будет идти о полипептидах, полученных расщеплением химотрипсином пептиды группы С, chymotryptic. Как видно из рисунка, если два Т-пептида являются соседними в исходной цепи, то существует С-пептид, который либо содержит в своем составе полностью оба или один из рассматриваемых Т-пептидов, либо как минимум содержит С-концевую часть левого и N-концевую часть правого пептида группы Т. Таким образом, просматривая структуры пептидов Т и С, можно для любой пары Т-пептидов выявить, являются ли они соседями в исследуемом белке или разделены одним или несколькими другими Т-пептидами. Неоднозначность может появиться только в том случае, если перекрываемый каким-либо из С-петидов концевой фрагмент встречается у двух или нескольких Т-пептидов. Вероятность этого как правило невелика. Если это все же происходит, то применяют более сложные методы комбинаторики. Методы исследования белков 7. Сайт создан в системе uCoz.
Одной из особенностей белков является их сложная структурная организация. Все белки обладают первичной, вторичной и третичной структурой, а те, которые в своем составе имеют две и больше ППЦ обладают и четвертичной структурой ЧС. Первичная структура белка ПСБ — это порядок чередования последовательность аминокислотных остатков в ППЦ. Даже одинаковые по своей длине и аминокислотному составу белки могут быть разными веществами. Например, из двух аминокислот можно составить 2 разных дипептида:. А если учесть, что в ППЦ каждая аминокислота может встретиться больше 1 раза, то число возможных вариантов трудно поддается подсчету. ПСБ белков можно определить с помощью фенилтиогидантоинового метода. В результате образуется комплекс этих двух соединений — ФИТЦ -АК. Например, рассмотрим пептид с целью определения его ПСБ, то есть последовательности соединения аминокислотных остатков. ФИТЦ взаимодействует с концевой аминокислотой а. Образуется комплекс ФТГ-а , его отделяют от смеси и определяют подлинность аминокислоты а. Например, это — асн и т. Последовательно отделяют и идентифицируют все остальные аминокислоты. Определение ПСБ белка среднего размера занимает несколько месяцев. Приоритет в расшифровке ПСБ принадлежит Сенджеру , который открыл ПСБ инсулина Лауреат Нобелевской премии. Молекула инсулина состоит из 2х ППЦ — A и B. А-цепь состоит из 21 аминокислоты, цепь В — из Между собой ППЦ соединяются дисульфидными мостиками. Число белков, ПСБ которых определена, к настоящему времени достигает Даже небольшие изменения первичной структуры могут существенно изменить свойства белка. С другой стороны, возможны варианты изменения ПСБ, которые не сказываются на его физико-химических и биологических свойствах. Например , HbC содержит в 6-м положении b-цепи вместо глу — лиз, HbС почти не отличается по своим свойствам от HbA, а люди, имеющие в эритроцитах такой Hb, практически здоровы. Стабильность ПСБ обеспечивается в основном прочными ковалентными пептидными связями и, во вторую очередь, дисульфидными связями. ППЦ белков обладают большой гибкостью и приобретают определенную пространственную структуру или конформацию. В белках различают 2 уровня такой конформации — это ВСБ и третичная структура ТСБ. ВСБ — это конфигурация ППЦ, то есть способ ее укладки или скручивания в какую-нибудь конформацию, в соответствии с программой, заложенной в П СБ. Ее модель предложена В. Она наиболее вероятна для глобулярных белков. Для любой системы наиболее устойчивым является состояние, соответствующее минимуму свободной энергии. Для пептидов такое состояние имеет место, когда CO— и NH— группы соединяются между собой слабой водородной связью. В a -спирали NH— группы 1-го аминокислотного остатка взаимодействует с CO—группой 4-ой по счету аминокислотой. В результате пептидный остов образует спираль, на каждый виток которой приходится 3,6 АК-остатка. Закручивание ППЦ происходит по часовой стрелке, то есть у спирали — правый ход. Через каждые 5 витков 18 АК; 2,7 нм конфигурация ППЦ повторяется. Стабилизируется ВСБ в первую очередь водородными связями, и во вторую — пептидными и дисульфидными. Водородные связи в раз слабее обычных химических связей; однако за счет их большого количества они обеспечивают определенную жесткость и компактность ВСБ. Боковые R-цепи a-спирали обращены к наружи и расположены по разные стороны от ее оси. Это складчатые участки ППЦ, по форме напоминающие листок, сложенный в гармошку. Слои ППЦ могут быть параллельными, если обе цепи начинаются с N— или С—конца. Если смежные цепи в слое ориентированы противоположными концами N—С и С—N, то они называются антипараллельными. Образование водородных связей происходит, как и в a-спирали, между CO— и NH— группами. Содержание a-спирали и b-структуры в разных белках неодинаково. Не вся ППЦ уложена в спирали или складчатые слои. FAQ Обратная связь Вопросы и предложения. Например, из двух аминокислот можно составить 2 разных дипептида: Определение первичной структуры белка псб. Вторичная структура белка всб. Известны три основных типа ВСБ: Соседние файлы в папке Лекция Механизм передачи гормонального сигнала..
Рассказ как живет семья
Meizu x5 характеристики
Phpbb стих двоюродному
Левомицетин физические свойства
Бланк сличительная ведомость основных средств