Биологический днк маркер для определения сортов картофеля, набор и способ сортовой идентификации картофеля
8.2. «Главные сценарии»
Вы точно человек?
Для определения сортовой принадлежности растений картофеля выделяют ДНК из свежего растительного материала и исследуют ее с помощью ПЦР. ПЦР проводят, используя набор, содержащий биологический маркер, реакционную смесь, состоящую из мкМ каждого динуклеотидтрифосфата dNTP, 1. Получают полиморфные маркеры ДНК, визуализируют их с помощью электрофореза в геле, а затем для типирования выявленных в изученной группе аллелей проводят сравнение аллельных спектров анализируемой и контрольной групп образцов. Биологический маркер, содержащий полиморфную ДНК, представляет собой специфическую нуклеотидную последовательность, получаемую при использовании диагностического набора из трех пар праймеров и характеризует сортовую принадлежность. Изобретение относится к биотехнологии, в частности к молекулярно-генетическим исследованиям, к области, связанной с сортовой идентификацией картофеля, контроля сортовой однородности картофеля, интрогрессии генетического материала в потомстве от скрещиваний при создании новых сортов. Известен способ молекулярного маркирования и идентификации пола хмеля обыкновенного с использованием двух комбинаций олигонуклеотидных праймеров для проведения полимеразной цепной реакции, которые обеспечивают амплификацию специфичных для мужских растений фрагментов ДНК RU 13 Недостатком этого способа является гено- и геномспецифичность праймеров, использование которых возможно только на хмеле и только для определения пола растений хмеля. Известен способ молекулярного маркирования селекционных достижений клевера лугового на основе RAPD-маркеров в оценке ДНК-полиморфизма RAPD-методом с использованием набора членных праймеров RU 13 Недостатком этого способа является малая воспроизводимость самого RAPD-метода и зачастую невозможность использования данных, полученных в разных лабораториях. Известен способ идентификации гибридов сельскохозяйственных культур путем определения аллельного состояния исследуемых локусов по продуктам амплификации, полученным с использованием праймеров к подобранным в тест-системе маркерам, сравнение генотипа образца с известными генотипами, причем отдельно выделяют ДНК и идентифицируют генотип материнской ткани семени и отдельно выделяют ДНК и идентифицируют генотип гибридной ткани семени UA 13 Недостатком этого способа является возможность его использования только для идентификации семян гибридов сельскохозяйственных культур и непригодность идентификации сортов картофеля. Известны способы идентификации генотипов ячменя на основе использования системы микросателлитных ДНК-маркеров UA 13 Также известны способы регистрации и паспортизации генотипов ячменя на основе анализа компонентов электрофоретического спектра, получаемого с помощью полимеразной цепной реакции IRAP UA 13 Вид документа U Недостатками данных способов является геном специфичность ячмень предлагаемых праймеров и, следовательно, непригодность их для сортовой идентификации картофеля. Наиболее близким к предлагаемому способу определения сортовой принадлежности культурных растений найдены следующие способы. Способы оценки типичности инбредных линий и уровня гибридности семян F1 подсолнечника по микросателлитным локусам НА , НА , НА и ORS 5 с использованием праймеров, соответствующих фланкирующим областям этих локусов RU 13 Известен способ классификации ржи по типу молекулы ДНК на основе анализа молекулы ДНК, выделенной из тканей зерна, ростков или других тканей, определение чистоты повторения аллелей микросателлитных локусов в различных сортах ржи и определение генотипа сорта в виде формулы UA 13 Известен способ идентификации генотипов подсолнечника с помощью определения и записи набора аллелей по микросателлитным локусам генома путем их амплификации в полимеразной цепной реакции и электрофореза в полиакриламидном геле. UA 13 Недостатками известных способов является геном специфичность подсолнечник, рожь предлагаемых праймеров и, следовательно, их непригодность для сортовой идентификации картофеля, а также отсутствие праймеров и набора для идентификации и паспортизации сортов картофеля, невозможность создания генетического паспорта сортов картофеля. Таким образом, изобретение - биологический ДНК маркер должен быть а специфичен для картофеля, то есть быть пригодным для анализа генотипов картофеля; б применим для идентификации и паспортизации сортов картофеля, то есть должен выявлять индивидуальные генетические особенности сортов картофеля. Изобретение также должно предполагать наличие набора пригодного для анализа генотипов картофеля, а также способа, обеспечивающего быстроту и точность анализа. Задачей предлагаемого изобретения является определение сортовой принадлежности наиболее распространенных и практически значимых сортов картофеля Solaum tuberosum , а также образцов родственных видов Solanum наиболее часто используемых в скрещиваниях при создании новых сортов картофеля и составление паспорта этих сортов картофеля. В результате использования предлагаемого биологического маркера для сортовой идентификации картофеля, набора и способа идентификации появляется возможность создания молекулярно-генетического паспорта сорта и повышение эффективности сортовой идентификации в генетико-селекционных мероприятиях, связанных с выведением новых сортов и размножением уже имеющихся элитных растений сортов. В таблице представлено распределение полиморфных биологических ДНК маркеров у сортов картофеля, а также аллельные формулы сортов, представляющие индивидуальные генетические характеристики паспорта каждого сорта. С помощью предлагаемого набора биологических ДНК маркеров и способа получения индивидуальных генетических характеристик осуществляется сортовая идентификация картофеля. Вышеуказанный результат достигается тем, что биологический маркер, содержащий полиморфную ДНК, характеризует сортовую принадлежность наиболее распространенных и хозяйственно значимых сортов картофеля и представляет собой специфическую нуклеотидную последовательность, получаемую при использовании диагностического набора из следующих трех пар праймеров. Результат достигается также тем, что используют набор для определения сортовой принадлежности растений картофеля, содержащий биологический маркер, реакционную смесь, состоящую из мкМ каждого динуклеотидтрифосфата dNTP, 1. ПЦР-анализ проводят, используя предлагаемый набор праймеров, получают полиморфные маркеры ДНК разного размера, визуализируют эти маркерные ДНК с помощью электрофореза в полиакриламидном или агарозном геле, затем для типирования выявленных в изученной группе аллелей проводят сравнение генетического разнообразия определяемой и контрольной групп образцов амплифицируемых фрагментов ДНК. Набор контрольных амплификатов содержит образцы амплифицированной ДНК, характерные для каждого из тестируемых сортов картофеля Solanum tuberosum. Сортовую принадлежность определяют по отсутствию или присутствию в исследуемой группе определенных сортоспецифических аллельных фенотипов. Размер амплифицируемых продуктов определяют с помощью маркера молекулярных масс 10 bp Ladder. В предлагаемом способе верификацию сортовой принадлежности проверяют с помощью различных вариантов многомерного анализа например, нейронных сетей Кахонена, кластерного анализа, метода главных компонент и т. Таким образом, генетическая идентификация растений сортов картофеля как отечественной, так и зарубежной селекции с применением предлагаемых биологических маркеров и набора осуществляется в результате фингерпринтинга сортов или коллекционных образцов картофеля. На заключительном этапе для каждой идентифицируемой группы составляют таблицу-паспорт с указанием распределения выявленных аллельных фенотипов и их аллелей по трем полиморфным локусам. На основании этой таблицы с высокой вероятностью либо визуально, либо с помощью многомерного статистического анализа определяют принадлежность или отсутствие принадлежности исследуемого растения картофеля к одному из сортов. Поэтому при наличии клубневого материала клубни предварительно проращивают до появления из глазковых почек листков. Выделение тотальной ДНК проводили по модифицированной методике Эдвардса Edwards et al. Выделение ДНК заключается в последовательном прохождении следующих фаз: Растительный материал в буфере при комнатной температуре гомогенизируют с помощью специальных пестиков. В пробирку со смесью, содержащей лизированные клетки и ядра, добавляют мкл предварительно охлажденного 5 М ацетата калия, смесь тщательно перемешивают и инкубируют на ледяной бане мин. После инкубации смесь центрифугируют 15 мин при g. Смесь фенола и хлороформа приготавливают путем смешивания равных объемов фенола и хлороформа. Готовый фенол содержит 0. Готовый хлороформ представляет собой смесь хлороформа и изоамилового спирта После чего верхнюю фазу с растворенной ДНК отбирают пипеткой, стараясь не захватывать интерфазу, содержащую белки и нижнюю фазу, содержащую фенол: Фенол-хлороформная депротеинизация повторяется раза до полной очистки раствора ДНК от белков. Осаждение ДНК производят путем добавления к очищенному супернатанту 0. Оценку качества и количества экстрагированной ДНК производят путем измерения оптической плотности раствора ДНК на анализаторе типа Биофотометр Bio Photometer Eppendorf либо путем проведения аналитического электрофореза. Измерение оптической плотности раствора ДНК при длине волны нм позволяет установить концентрацию и чистоту нуклеиновых кислот. Отношение величины D при длине волны нм к D при длине волны нм позволяет судить о чистоте нуклеиновой кислоты. Для чистых препаратов ДНК это соотношение должно быть 1. Определение концентрации и качества выделенных образцов ДНК методом электрофореза в агарозном геле проводится в горизонтальной камере в 1 х трис-боратным буфере ТВЕ , рН 7,,8 0, М трис, 0, М борной кислоты и 0, М ЭДТА. При внесении ДНК в карманы геля используется буфер для нанесения 0. После электрофореза гель окрашивают в растворе бромистого этидия в течение минут или добавляют бромистый этидий непосредственно в гель. Вхождение ДНК в гель осуществляют при 50 V в течение минут, далее электрофорез ведут при V в течение часов. Выделенную ДНК используют в качестве матрицы в реакции амплификации. Амплификацию ДНК проводят в реакционной смеси объемом 15 мкл, содержащей 1х буфер из соответствующего набора, 0,16 мМ каждого dNTP, 1. Для проведения ПЦР предлагается использовать три пары праймеров следующего состава:. Продукты амплификации подвергают аналитическому электрофорезу в 1. Вхождение фрагментов в гель осуществляют при 50 V в течение минут, а разделение фрагментов - в течение часов при V. Визуализацию осуществляют путем окрашивания гелей азотнокислым серебром из набора Silver Sequence Staining Kit Promega, США согласно инструкции производителя с последующим фотографированием цифровым фотоаппаратом Nicon либо любой другой системы визуализации. Затем проводят статистическую обработку результатов и составляют сортовой молекулярно-генетический паспорт. Для типирования аллельных вариантов определения размера в п. Набор контрольных амплификатов может содержать в среднем от 5 до 20 образцов амплификатов, характерных для микросателлитных аллельных вариантов. Отсутствие или присутствие в исследуемой группе генотипов растений определенных аллелей или аллельных сочетаний позволяет надежно определять сортовую принадлежность. Верификацию сортовой принадлежности проводят с помощью различных вариантов многомерного кластерного анализа, нейронных сетей Кахонена, дискриминантного анализа или метода главных компонент , в котором в качестве обучающей выборки может служить выборка аллельных вариантов и аллельных фенотипов одного из ранее изученных сортов картофеля. Список сортов картофеля, которые могут служить обучающей выборкой и для которых известно генетическое разнообразие и сортоспецифические аллели и аллельные фенотипы, представлен в табл. Из растительного материала сортов картофеля выделяют ДНК способом, указанным выше. Полученные продукты амплификации визуализируют путем электрофореза в геле, и после окрашивания геля нитратом серебра идентифицируют маркерные аллели различной длины, представляющие аллельные фенотипы сортов картофеля. Каждый из сортов характеризуется определенным набором или сочетанием аллелей, то есть сортоспецифичными аллельными фенотипами, представленными в таблице 2. Это распределение служит эталоном при сравнении и идентификации растений неизвестных сортов картофеля. Путем сравнения распределения полиморфных ДНК разной длины среди исследуемых и эталонных образцов определяют сортовую принадлежность. Полученные амплификационные продукты визуализируют путем электрофореза в геле, и после окрашивания геля нитратом серебра идентифицируют маркерные аллели различной длины, представляющие аллельные фенотипы сортов картофеля. Каждый из сортов характеризуется определенным набором или сочетанием аллелей, то есть сортоспецифичными аллельными фенотипами, представленными в таблице 3, Это распределение служит эталоном при сравнении и идентификации растений неизвестных сортов картофеля. Каждый из сортов характеризуется определенным набором или сочетанием аллелей, то есть сортоспецифичными аллельными фенотипами, представленными в таблице 4. Молекулярно-генетический паспорт по всем трем парам праймеров составляется для каждого известного сорта и представлен в таблице 1. Аналогичный паспорт можно составить для любой выборки растений неизвестного происхождения. Биологический маркер, содержащий полиморфную ДНК, характеризующий сортовую принадлежность наиболее распространенных и хозяйственно значимых сортов картофеля, и представляющий собой нуклеотидные последовательности из группы трех пар праймеров следующего состава: Набор для определения сортовой принадлежности растений картофеля, содержащий биологический маркер по п. Способ определения сортовой принадлежности растений картофеля, включающий выделение ДНК из свежего растительного материала, исследование геномной ДНК картофеля с помощью ПЦР, отличающийся тем, что ПЦР-анализ проводят, используя набор по п. Биологический днк маркер для определения сортов картофеля, набор и способ сортовой идентификации картофеля. Кочиева Елена Зауровна RU. Мартиросян Елена Володяи RU. Скрябин Константин Георгиевич RU. Рыжова Наталья Николаевна RU. Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицинской практике. Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу амплификации специфичных фрагментов нуклеиновых кислот с помощью полимеразной цепной реакции в конвекционной ячейке Бенара-Рэлея. Изобретение относится к области животноводства, в частности к кормам для животных. Изобретение относится к выделенному вирусу растений, названному вирус томата торрадо ToTV , и его компонентам, а также к способам получения устойчивых к ToTV растений. Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к набору праймеров для амплификации гена L1 папилломавируса человека HPV , набору для детектирования генотипа папилломавируса человека HPV и к способам детектирования генотипов папилломавируса человека HPV. Изобретение относится к биотехнологии, лазерной технике и медицине. Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу амплификации специфичных фрагментов нуклеиновых кислот. Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к молекулярно-генетическим исследованиям, а именно к области диагностики генетической предрасположенности к различным видам физических нагрузок и особенностей тренировочного процесса. Изобретение относится к области биотехнологии, генной инженерии и вирусологии. Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления днк возбудителя человеческого моноцитарного эрлихиоза ehrlichia spp. Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к набору синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК возбудителя человеческого моноцитарного эрлихиоза МЭЧ - патогенных представителей рода Ehrlichia методом полимеразной цепной реакции. Изобретение относится к области медицинской микробиологии, в частности к подвидовой дифференциации штаммов возбудителя чумы. Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к синтетическим олигонуклеотидным праймерам, комплементарным консервативной области S-сегмента генома вируса болезни Найроби овец, способу выявления вируса болезни Найроби овец и к тест-системе для обнаружения ДНК вируса болезни Найроби овец. Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к синтетическим олигонуклеотидным праймерам, комплементарным высоко консервативной области гена VP60 генома вируса вирусной геморрагической болезни кроликов, способу выявления вируса вирусной геморрагической болезни кроликов и к тест-системе для выявления РНК вируса вирусной геморрагической болезни кроликов. Изобретение относится к области молекулярной биологии и может быть использовано в медицинской генетике. Изобретение относится к области медицины, биологии и биотехнологии и может быть использовано в качестве дополнительного метода обследования пациентов при ранней диагностике воспалительного процесса при раннем ревматоидном артирите. Оказать финансовую помощь проекту FindPatent.
Обновить bios ami из под windows
Славянская кукла оберег своими руками
Сытин белый шум рекомендации по прослушиванию
Маточное кровотечение помощь
Последние новости нумизматики
Сколько масла в двигателе астра 1.4