Применение сканирующего зондового микроскопа для исследования биологических объектов 1. Информация для преподавателя 3. Лабораторная работа была разработана Нижегородским Государственным Университетом им. Исследование морфологических параметров биологических структур является важной задачей для биологов, поскольку размеры и форма некоторых структур во многом определяют их физиологические свойства. Сопоставляя морфологические данные с функциональными характеристиками можно получить полноценную информацию об участии живых клеток в поддержании физиологического баланса организма человека или животного. Раньше биологи и медики имели возможность изучать свои препараты только на оптическом и электронном микроскопах. Эти исследования давали некую картину морфологии клеток, зафиксированных, окрашенных и с тонкими металлическими покрытиями, полученными путем напыления. Исследовать морфологию живых объектов, ее изменения под воздействием различных факторов не представлялось возможным, но являлось весьма заманчивым. Сканирующая зондовая микроскопия СЗМ открыла новые возможности в исследовании клеток, бактерий, биологических молекул, ДНК в условиях максимально приближенных к нативным. СЗМ позволяет исследовать биологические объекты без специальных фиксаторов и красителей, на воздухе, или даже в жидкой среде. В настоящее время СЗМ используется в большом многообразии дисциплин, как в фундаментальных научных исследованиях, так и в прикладных высокотехнологичных разработках. Многие научно-исследовательские институты страны оснащаются аппаратурой зондовой микроскопии. В связи с этим постоянно растет спрос на высококлассных специалистов. Для его удовлетворения фирмой НТ-МДТ г. Зеленоград, Россия разработана специализированная учебно-научная лаборатория сканирующей зондовой микроскопии NanoEducator. СЗМ NanoEducator специально разработан для проведения студентами лабораторных работ. Этот прибор ориентирован на студенческую аудиторию: В данной лабораторной работе Вы узнаете о сканирующей зондовой микроскопии, познакомитесь с ее основами, изучите конструкцию и принципы работы учебного СЗМ NanoEducator , научитесь готовить биологические препараты для исследований, получите свое первое СЗМ изображение комплекса кисломолочных бактерий и научитесь основам обработки и представления результатов измерений. Подготовка образца выполняется каждым студентом индивидуально. Получение первого изображения выполняется на одном приборе под контролем преподавателя, далее каждый студент исследует свой образец самостоятельно. Обработка экспериментальных данных каждым студентом производится индивидуально. До начала работы необходимо подобрать зонд с наиболее характерной амплитудно-частотной характеристикой одиночный симметричный максимум , получить изображение поверхности исследуемого образца. Методы исследований морфологии биологических объектов. Знакомство с конструкцией и программой управления СЗМ NаnoEducator. Обработка и анализ полученных изображений. Количественная характеризация СЗМ изображений. Поэтому первое изучение клеток стало возможным только после появления оптических микроскопов. В конце XVII в. Антонио ван Левенгук изготовил первый оптический микроскоп, до этого люди и не подозревали о существовании болезнетворных микробов и бактерий [Лит. Трудности изучения клеток связаны с тем, что они бесцветны и прозрачны, поэтому открытие их основных структур состоялось только после введения в практику красителей. Красители обеспечили достаточный контраст изображения. С помощью оптического микроскопа можно различать объекты, отстоящие друг от друга на 0. Изображения более мелких элементов клеток искажаются эффектами, вызванными волновой природой света. Для приготовления долго сохраняющихся препаратов клетки обрабатывают фиксирующим агентом с тем, чтобы иммобилизовать и сохранить их. Кроме того, фиксация повышает доступность клеток красителям, так как макромолекулы клеток скрепляются поперечными сшивками, что стабилизирует и закрепляет их в определенном положении. Чаще всего в качестве фиксаторов выступают альдегиды и спирты например, глутаральдегид или формальдегид формируют ковалентные связи со свободными аминогруппами белков и сшивают соседние молекулы. После фиксации ткани обычно нарезают микротомом на очень тонкие срезы толщиной от 1 до 10 мкм , которые затем помещают на предметное стекло. При таком способе подготовки можно повредить структуру клеток или макромолекул, поэтому предпочтительным методом является быстрое замораживание. Замороженную ткань режут микротомом, установленным в холодной камере. После приготовления срезов клетки окрашивают. В основном для этой цели используют органические красители малахитовую зелень, судан черный и т. Каждый из них характеризуется определенным сродством к клеточным компонентам, например, гематоксилин обладает сродством к отрицательно заряженным молекулам, поэтому позволяет выявить в клетках ДНК. Если та или иная молекула представлена в клетке в незначительном количестве, то удобнее всего использовать флуоресцентную микроскопию. Флуоресцирующие красители поглощают свет одной длины волны и излучают свет другой, большей длины волны. Если такое вещество облучить светом, длина волны которого совпадает с длиной волны света, поглощаемого красителем, и затем для анализа использовать фильтр, пропускающий свет с длиной волны, соответствующей свету, излучаемому красителем, флуоресцирующую молекулу можно выявить по свечению на темном поле. Высокая интенсивность излучаемого света является характерной особенностью таких молекул. Применение флуоресцирующих красителей для окраски клеток предполагает использование специального флуоресцентного микроскопа. Такой микроскоп похож на обычный оптический, но свет от мощного осветителя проходит через два набора фильтров - один для задержания части излучения осветителя перед образцом и другой для фильтрации света, полученного от образца. Первый фильтр выбран таким образом, что он пропускает лишь свет длины волны, возбуждающей определенный флуоресцирующий краситель; в то же время второй фильтр блокирует этот падающий свет и пропускает свет длины волны, излучаемой красителем при его флуоресценции. Флуоресцентная микроскопия часто используется для выявления специфических белков или других молекул, которые становятся флуоресцирующими после ковалентного связывания с флуоресцирующими красителями. Для этой цели обычно используют два красителя - флуоресцеин, который дает интенсивную желто-зеленую флуоресценцию после возбуждения светло-голубым светом, и родамин, обусловливающий темно-красную флуоресценцию после возбуждения желто-зеленым светом. Применяя для окраски и флюоресцин и родамин можно получать распределение различных молекул. Простейший способ разглядеть детали клеточной структуры — наблюдать свет, рассеивающийся различными компонентами клетки. В темнопольном микроскопе лучи от осветителя направляются сбоку и при этом в объектив микроскопа попадают только рассеянные лучи. Соответственно, клетка выглядит как освещенный объект на темном поле. Одним из основных преимуществ темнопольной микроскопии является возможность наблюдать движение клеток в процессе деления и миграции. Клеточные движения, как правило, совершаются очень медленно и их сложно наблюдать в реальном времени. В этом случае используют покадровую цейтраферную микрокиносъемку или видеозапись. Последовательные кадры при этом разделены во времени, но при воспроизведении записи с нормальной скоростью картина реальных событий ускоряется. В последние годы видеокамеры и соответствующие технологии обработки изображения значительно увеличили возможности оптической микроскопии. Благодаря их применению удалось преодолеть трудности, обусловленные особенностями физиологии человека. Они состоят в том, что:. Глаз в обычных условиях не регистрирует очень слабый свет. Глаз не способен фиксировать небольшие отличия в интенсивности света на ярком фоне. Первая из этих проблем была преодолена после присоединения к микроскопу сверхвысокочувствительных видеокамер. Это позволило наблюдать клетки в течение длительного времени при низкой освещенности, исключая длительное воздействие яркого света. Системы обработки изображения особенно важны для изучения в живых клетках флуоресцирующих молекул. Поскольку изображение создается видеокамерой в форме электронных сигналов, его можно соответствующим образом преобразовать в числовые сигналы, направить в компьютер и затем подвергнуть дополнительной обработке для извлечения скрытой информации. Высокий контраст, достижимый с помощью компьютерной интерференционной микроскопии, позволяет наблюдать даже очень мелкие объекты, как, например, отдельные микротрубочки, диаметр которых менее одной десятой длины волны света 0. Отдельные микротрубочки можно увидеть и с помощью флуоресцентной микроскопии. Однако в обоих случаях неизбежны эффекты дифракции, сильно изменяющие изображение. Диаметр микротрубочек при этом завышается 0. Для решения этой задачи необходим электронный микроскоп, предел разрешения которого сдвинут далеко за пределы длины волны видимого света. Взаимосвязь длины волны и предела разрешения сохраняется и для электронов. Однако для электронного микроскопа предел разрешения существенно ниже дифракционного предела. Длина волны электрона уменьшается с увеличением его скорости. Согласно теории, разрешение такого микроскопа в пределе составляет 0. Однако в реальности вследствие малой величины числовых апертур электронных линз разрешение современных электронных микроскопов в лучшем случае составляет 0,1 нм. Трудности приготовления образца, его повреждение излучением существенно снижают нормальное разрешение, которое для биологических объектов составляет 2 нм примерно в раз выше, чем у светового микроскопа. Источником электронов в просвечивающем электронном микроскопе ПЭМ является нить катода, расположенная в вершине цилиндрической колонны высотой около двух метров. Чтобы избежать рассеивания электронов при столкновениях с молекулами воздуха, в колонне создается вакуум. Электроны, излучаемые катодной нитью, ускоряются ближайшим анодом и проникают через крошечное отверстие, формируя электронный луч, проходящий в нижнюю часть колонны. Вдоль колонны на некотором расстоянии расположены кольцевые магниты, фокусирующие электронный луч, подобно стеклянным линзам, фокусирующим луч света в оптическом микроскопе. Образец через воздушный шлюз помещают внутрь колонны, на пути электронного пучка. Часть электронов в момент прохождения через образец рассеивается в соответствии с плотностью вещества в данном участке, остаток электронов фокусируется и формирует изображение подобно формированию изображения в оптическом микроскопе на фотопластинке или на фосфоресцирующем экране. Одним из самых больших недостатков электронной микроскопии является то, что биологические образцы необходимо подвергнуть специальной обработке. Во-первых, их фиксируют сначала глутаровым альдегидом, а затем осмиевой кислотой, связывающей и стабилизирующей двойной слой липидов и белков. Во-вторых, электроны обладают низкой проникающей способностью, поэтому приходится делать сверхтонкие срезы, а для этого образцы обезвоживают и пропитывают смолами. В-третьих, для усиления контраста образцы обрабатывают солями тяжелых металлов, такими как осмий, уран и свинец. Для того, чтобы получить трехмерное изображение поверхности используется сканирующий электронный микроскоп СЭМ , где используются электроны, рассеиваемые или излучаемые поверхностью образца. Образец в данном случае фиксируют, высушивают и покрывают тонкой пленкой тяжелого металла, а затем сканируют узким пучком электронов. При этом оценивается количество электронов, рассеиваемых при облучении поверхности. Полученное значение используют для контроля интенсивности второго луча, движущегося синхронно первому и формирующему изображение на экране монитора. Разрешение метода около 10 нм и он не применим для изучения внутриклеточных органелл. Толщина образцов, изучаемых этим методом, определяется проникающей способностью электронов или их энергией. Основными и существенными недостатками всех этих методов является длительность, сложность и высокая стоимость приготовления образца. В сканирующем зондовом микроскопе СЗМ вместо электронного луча или оптического излучения используется острийный зонд, игла, сканирующая поверхность образца. Образно выражаясь, можно сказать, что если в оптическом или электронном микроскопах образец осматривается, то в СЗМ — ощупывается. В результате можно получать трехмерные изображения объектов в разных средах: Специальные конструкции СЗМ, адаптированные для биологических исследований, позволяют одновременно с оптическим наблюдением сканировать как живые клетки в разных жидких средах, так и фиксированные препараты на воздухе. В названии сканирующего зондового микроскопа отражен принцип его действия — сканирование поверхности образца, при котором осуществляется поточечное считывание степени взаимодействия зонда с поверхностью. Чем больше задается точек, тем с большим разрешением получается изображение поверхности. Расстояние между точками считывания сигнала называется шагом сканирования. Шаг сканирования должен быть меньше изучаемых деталей поверхности. Перемещение зонда в процессе сканирования см. Схематическое изображение процесса сканирования считывание сигнала осуществляется на прямом ходе сканера. В зависимости от характера считываемого сигнала, сканирующие микроскопы имеют различные названия и назначения:. Используются зонды, кончик которых покрыт тонкой проводящей пленкой золото или платина. СЗМ состоит из следующих основных компонентов Рис 7 Схема сканирующего зондового микроскопа. Зондовый датчик — компонент силового зондового микроскопа, осуществляющий сканирование препарата. Зондовый датчик содержит кантилевер пружинную консоль прямоугольного I- образного или треугольного V-образного типов Рис. Другим концом кантилевер стыкуется с подложкой с так назывемым чипом. Зондовые датчики изготавливаются из кремния или нитрида кремния. Основной характеристикой кантилевера является силовая константа константа жесткости , она варьируется от 0. Изображения пирамидальных АСМ зондовых датчиков полученное с помощью электронного микроскопа: Пьезоэлектрические приводы или сканеры — для контролируемого перемещения зонда над образцом или самого образца относительно зонда на сверхмалых расстояниях. В пьезоэлектрических приводах используются пьезокерамические материалы, которые изменяют свои размеры при приложении к ним электрического напряжения. Процесс изменения геометрических параметров под действием электрического поля называется обратным пьезоэффектом. Наиболее распространенный пьезоматериал - цирконат-титанат свинца. Сканер - конструкция из пьезокерамики, обеспечивающая перемещение по трем координатам: Существует несколько типов сканеров, наиболее распространенными из которых являются триподные и трубчатые Рис. В триподном сканере перемещения по трем координатам обеспечивают образующие ортогональную структуру три независимых пьезокерамических стержня. В трубчатом сканере полая пьезоэлектрическая трубка изгибается в плоскостях XZ и ZY и удлиняется или сжимается по оси Z при подаче соответствующих напряжений на электроды, управляющие перемещениями трубки. Электроды для управления движением в плоскости XY расположены на наружной поверхности трубки, для управления перемещением по Z на X и Y электроды подаются равные напряжения. Цепь обратной связи — совокупность элементов СЗМ, с помощью которой при сканировании зонд удерживается на фиксированном расстоянии от поверхности образца Рис. Схема обратной связи сканирующего зондового микроскопа. При приближении зонда к поверхности возрастают силы взаимодействия зонд-образец, возрастает и сигнал регистрирующего устройства V t , который выражается в единицах напряжения. Компаратор сравнивает сигнал V t с опорным напряжением V опорное и вырабатывает корректирующий сигнал V корр. Сигнал коррекции V корр подается на сканер, и зонд отводится от образца. Опорное напряжение — напряжение, соответствующее сигналу регистрирующего устройства, когда зонд оказывается на заданном расстоянии от образца. Поддерживая в процессе сканирования это заданное расстояние зонд-образец, система обратной связи поддерживает заданную силу взаимодействия зонд-образец. Траектория относительного движения зонда в процессе поддержания системой обратной связи постоянной силы взаимодействия зонд-образец. Если зонд оказывается над ямкой, на сканер подается напряжение, при котором сканер удлиняется, опуская зонд. Быстрота отклика цепи обратной связи на изменение расстояния зонд-образец взаимодействия зонд-образец определяется константой цепи обратной связи K. Значения K зависят от особенностей конструкции конкретного СЗМ конструкции и характеристик сканера, электроники , режима работы СЗМ размера области сканирования, скорости сканирования и т. В СТМ регистрирующим устройством Рис. Зонд представляет собой остро заточенную иглу, радиус закругления острия которой может достигать нескольких нанометров. В качестве материала для зонда обычно используются металлы с высокой твердостью и химической стойкостью: Между проводящим зондом и проводящим образцом прикладывается напряжение. Когда кончик зонда оказывается на расстоянии около 10А от образца, электроны из образца начинают туннелировать через промежуток в зонд или наоборот, в зависимости от знака напряжения Рис. Схематическое изображение взаимодействия кончика зонда с образцом. Возникающий при этом туннельный ток измеряется регистрирующим устройством. Его величина I Т пропорциональна приложенному к туннельному контакту напряжению V и экспоненциально зависит от расстояния от иглы до образца d. Таким образом, малым изменениям расстояния от кончика зонда до образца d отвечают экспоненциально большие изменения туннельного тока I Т предполагается, что напряжение V поддерживается постоянным. В силу этого чувствительность туннельного зондового датчика достаточна, чтобы зарегистрировать изменения высот менее 0,1 нм, и, следовательно, получить изображение атомов на поверхности твердого тела. Наиболее распространенным зондовым датчиком атомно-силового взаимодействия является пружинный кантилевер от англ. Величина изгиба кантилевера, возникающего вследствие силового взаимодействия между образцом и зондом Рис 7 -9 , измеряется с помощью оптической схемы регистрации. Принцип действия силового датчика основан на использовании атомных сил, действующих между атомами зонда и атомами образца. При изменении силы зонд-образец меняется величина изгиба кантилевера, и такое изменение измеряется оптической системы регистрации. Таким образом, атомно-силовой датчик представляет собой острийный зонд с высокой чувствительностью, позволяющей регистрировать силы взаимодействия между отдельным атомами. При малых изгибах соотношение между силой зонд-образец F и отклонением кончика кантилевера x определяется законом Гука:. Для измерения столь малых перемещений обычно используется оптический датчик смещений Рис 7 -9 , состоящий из полупроводникового лазера и четырехсекционного фотодиода. При изгибе кантилевера отраженный от него луч лазера смещается относительно центра фотодетектора. Таким образом, изгиб кантилевера может быть определен по относительному изменению освещенности верхней T и нижней B половинок фотодетектора. Зависимость сил взаимодействия зонд-образец от расстояния зонд-образец. При приближении зонда к образцу он сначала притягивается к поверхности благодаря наличию притягивающих сил силы Ван-дер-Ваальса. При дальнейшем приближении зонда к образцу электронные оболочки атомов на конце зонда и атомов на поверхности образца начинают перекрываться, что приводит к появлению отталкивающей силы. При дальнейшем уменьшении расстояния отталкивающая сила становится доминирующей. В общем виде зависимость силы межатомного взаимодействия F от расстояния между атомами R имеет вид:. Константы a и b и показатели степени m и n зависят от сорта атомов и типа химических связей. Качественно зависимость F R показана на Рис. Зависимость силы взаимодействия между атомами от расстояния. Данные о морфологии поверхности, полученные при исследовании на оптическом микроскопе, представляются в виде увеличенного изображения участка поверхности. Информация, получаемая с помощью СЗМ, записывается в виде двухмерного массива целых чисел A ij. Каждому значению ij соответствует определенная точка поверхности в пределах поля сканирования. Графическое отображение этого массива чисел называется СЗМ сканированным изображением. Сканированные изображения могут быть как двумерными 2D , так и трехмерными 3D. Наиболее эффективным способом раскраски 3D изображений является моделирование условий подсветки поверхности точечным источником, расположенным в некоторой точке пространства над поверхностью Рис. При этом удается подчеркнуть отдельные малые особенности рельефа. Бактерии — одноклеточные микроорганизмы, имеющие разнообразную форму и сложную структуру, определяющую многообразие их функциональной деятельности. Для бактерий характерны четыре основные формы: Кокки бактерии шаровидной формы — в зависимости от плоскости деления и расположения отдельных особей подразделяются на микрококки отдельно лежащие кокки , диплококки парные кокки , стрептококки цепочки кокков , стафилококки имеющие вид виноградных гроздьев , тетракокки образования из четырех кокков и сарцины пакеты из 8 или 16 кокков. Палочковидные — бактерии располагаются в виде одиночных клеток, дипло- или стрептобактерий. Извитые — вибрионы, спириллы и спирохеты. Вибрионы имеют вид слегка изогнутых палочек, спириллы — извитую форму с несколькими спиральными завитками. Размеры бактерий колеблются от 0. В состав бактериальной клетки входят капсула, клеточная стенка, цитоплазматическая мембрана и цитоплазма. В цитоплазме находятся нуклеотид, рибосомы и включения. Некоторые бактерии снабжены жгутиками и ворсинками. Ряд бактерий образуют споры. Превышая исходный поперечный размер клетки, споры придают ей веретенообразную форму. Для изучения морфологии бактерий на оптическом микроскопе из них готовят нативные прижизненные препараты или фиксированные мазки, окрашенные анилиновым красителем. Существуют специальные методы окраски для выявления жгутиков, клеточной стенки, нуклеотида и разных цитоплазматических включений. Для СЗМ исследования морфологии бактериальных клеток не требуется окрашивания препарата. СЗМ позволяет с высокой степенью разрешения определить форму и размер бактерий. При тщательном приготовлении препарата и использовании зонда с малым радиусом закругления возможно выявление жгутиков. Для первого опыта работы с СЗМ рекомендуется выбрать биологический препарат, который не требует сложной подготовки. Вполне подойдут легкодоступные и непатогенные кисломолочные бактерии из рассола квашеной капусты или кисломолочных продуктов. Для СЗМ исследования на воздухе требуется прочно зафиксировать исследуемый объект на поверхности подложки, например, на покровном стекле. Кроме того, плотность бактерий в суспензии должна быть такова, чтобы клетки при осаждении на подложку не слипались, и расстояние между ними было не слишком велико, чтобы при сканировании можно было в один кадр взять несколько объектов. Эти условия выполняются, если правильно выбрать режим приготовления образца. Если нанести каплю раствора, содержащего бактерии, на подложку, то будет происходить их постепенное осаждение и адгезия. Основными параметрами при этом следует считать концентрацию клеток в растворе и время осаждения. Концентрацию бактерий в суспензии определяют по оптическому стандарту мутности. В нашем случае роль будет играть лишь один параметр — время инкубации. Чем дольше выдерживать каплю на стекле, тем больше окажется плотность бактериальных клеток. В то же время, если капля жидкости начнет подсыхать, то препарат будет слишком сильно загрязнен осадившимися компонентами раствора. Каплю раствора, содержащего бактериальные клетки рассол , наносят на покровное стекло, выдерживают минут в зависимости от состава раствора. Затем, не дожидаясь высыхания капли, тщательно промывают дистиллированной водой обмакивая препарат пинцетом в стакан несколько раз. После высушивания препарат готов для измерения на СЗМ. Для примера приготовили препараты кисломолочных бактерий из рассола квашеной капусты. Время выдерживания капли рассола на покровном стекле выбрали 5 мин, 20 мин и 1 час капля уже начала подсыхать. СЗМ - кадры представлены на Рис. Увеличение времени выдерживания капли на поверхности подложки приводит к слипанию бактериальных клеток. В случае же, когда капля раствора начинает подсыхать, наблюдается осаждение на стекло компонентов раствора, которые невозможно отмыть. Изображения кисломолочных бактерий на покровном стекле, полученные с помощью СЗМ. Время инкубации раствора 5 мин. Время инкубации раствора 20 мин. Время инкубации раствора 1 час. На одном из отобранных препаратов Рис. АСМ - изображение кисломолочных бактерий на покровном стекле. АСМ - изображение цепочки кисломолочных бактерий на покровном стекле. Для рассола характерна форма бактерий палочковидной формы и расположение в виде цепочки. Окно управляющей программы учебного СЗМ NаnoEducator. Используя инструменты программы учебного СЗМ NаnoEducator мы определили размеры бактериальных клеток. Они составили примерно от 0. Полученные результаты сопоставляем с данными, приведенными в определителе бактерий Берджи [Лит. Кисломолочные бактерии относятся к лактобактериям Lactobacillus. Клетки имеют вид палочек, обычно правильной формы. Палочки длинные, иногда почти кокковидные, обычно в коротких цепочках. Размеры 0,5 — 1,2 Х 1,0 — 10 мкм. Спор не образуют; в редких случаях подвижны за счет перитрихиальных жгутиков. Широко распространены в окружающей среде, особенно часто встречаются в пищевых продуктах животного и растительного происхождения. Кисломолочные бактерии входят в нормальную микрофлору пищеварительного тракта. Всем известно, что квашеная капуста, помимо содержания в ней витаминов, полезна для улучшения микрофлоры кишечника. Конструкция сканирующего зондового микроскопа NanoEducator. Внешний вид измерительной головки СЗМ NanoEducator 1- основание, 2-держатель образца, 3- Датчик взаимодействия, 4-винт фиксации датчика, 5-винт ручного подвода, 6-винты перемещения сканера с образцом в горизонтальной плоскости, 7-защитная крышка с видеокамерой. На основании 1 расположены сканер 8 с держателем образца 7 и механизм подвода образца к зонду 2 на основе шагового двигателя. В учебном СЗМ NanoEducator образец закрепляется на сканер, и осуществляется сканирование образцом относительно неподвижного зонда. Подвод зонда 6, закрепленного на датчике силового взаимодействия 4, к образцу можно также осуществлять с помощью винта ручного подвода 3. Предварительный выбор места исследования на образце осуществляется с помощью винта 9. Учебный СЗМ NanoEducator состоит из соединенных кабелями измерительной головки, СЗМ контроллера и управляющего компьютера. Сигнал от датчика взаимодействия после преобразования в предусилителе поступает в СЗМ контроллер. Управление работой СЗМ NanoEducator осуществляется от компьютера через СЗМ контроллер. На внутреннюю поверхность трубки нанесен проводящий электрод. На внешнюю поверхность трубки нанесены два электрически изолированных полуцилиндрических электрода. К свободному концу трубки прикреплена вольфрамовая проволока диаметром мкм Рис. Конструкция универсального датчика прибора NanoEducator. Свободный конец проволоки, использующейся в качестве зонда, заточен электрохимически, радиус закругления имеет величину 0. Зонд имеет электрический контакт с внутренним электродом трубки, соединенным с заземленным корпусом прибора. Наличие двух внешних электродов на пьезоэлектрической трубке позволяет в качестве датчика силового взаимодействия датчика механических колебаний использовать одну часть пьезоэлектрической трубки верхнюю, в соответствии с Рис. К пьезовибратору подводится переменное электрическое напряжение с частотой, равной резонансной частоте силового датчика. Амплитуда колебаний при большом расстоянии зонд-образец максимальна. Как видно из Рис. При приближении зонда к поверхности образца зонд начинает касаться образца в процессе колебаний. Это приводит к смещению амплитудно-частотной характеристики АЧХ колебаний датчика влево по сравнению с АЧХ, измеренной вдали от поверхности Рис. Эта амплитуда колебаний регистрируется со второй части пьезотрубки. Принцип работы пьезоэлектрической трубки в качестве датчика силового взаимодействия. Изменение частоты колебаний силового датчика при приближении к поверхности образца. Способ организации микроперемещений, использующийся в приборе NanoEducator , основан на использовании зажатой по периметру металлической мембраны, к поверхности которой приклеена пьезопластинка Рис. Изменение размеров пьезопластинки под действием управляющего напряжения будет приводить к изгибу мембраны. Расположив такие мембраны по трем перпендикулярным сторонам куба и соединив их центры металлическими толкателями, можно получить 3 х -координатный сканер Рис. Принцип действия а и конструкция б сканера прибора NanoEducator. Каждый пьезоэлемент 1, закрепленный на гранях куба 2, при приложении к нему электрического напряжения может передвигать прикрепленный к нему толкатель 3 в одном из трех взаимно перпендикулярных направлений — X, Y или Z. Как видно из рисунка, все три толкателя соединены в одной точке 4. С некоторым приближением можно считать, что эта точка перемещается по трем координатам X, Y, Z. К этой же точке прикрепляется стойка 5 с держателем образца 6. Таким образом, образец перемещается по трем координатам под действием трех независимых источников напряжения. Механизм автоматизированного подвода зонда к образцу захват обратной связи. Диапазон перемещений сканера по оси Z составляет около 10 мкм, поэтому перед началом сканирования необходимо приблизить зонд к образцу на это расстояние. Для этого предназначен механизм подвода, схема которого приведена на Рис. Шаговый двигатель 1 при подаче на него электрических импульсов вращает винт подачи 2 и перемещает планку 3 с зондом 4, приближая или отдаляя его от образца 5, установленного на сканере 6. Величина одного шага составляет около 2 мкм. Схема механизма подвода зонда к поверхности образца. Так как шаг механизма подвода значительно превосходит величину требуемого расстояния зонд-образец в процессе сканирования, то во избежание деформации зонда его подвод осуществляется при одновременной работе шагового двигателя и перемещениям сканера по оси Z по следующему алгоритму:. Механизм подвода зонда производит один шаг и останавливается. Система обратной связи включается, и сканер плавно поднимает образец, одновременно производится анализ наличия взаимодействия зонд-образец. Если взаимодействие отсутствует, процесс повторяется с пункта 1. Если во время вытягивания сканера вверх появится ненулевой сигнал, система обратной связи остановит движение сканера вверх и зафиксирует величину взаимодействия на заданном уровне. Величина силового взаимодействия, при котором произойдет остановка подвода зонда и будет происходить процесс сканирования, в приборе NanoEducator характеризуется параметром Подавление амплитуды Amplitude Suppression:. После вызова программы NanoEducator на экране компьютера появляется главное окно программы Рис. Работу следует начать с пункта меню Файл и в нем выбрать Открыть или Новый либо соответствующие им кнопки на панели инструментов ,. Программа позволяет осуществлять просмотр и обработку данных параллельно с измерениями. Существует возможность выбора другой рабочей папки во время проведения измерений. Для этого необходимо нажать кнопку , расположенную на панели инструментов главного окна программы и выбрать пункт меню Изменить рабочую папку. По умолчанию файл будет сохранен в рабочей папке, назначенном перед началом измерений. О наличии временных файлов результатов измерений в рабочей папке выдается предупреждение перед закрытием и после запуска программы. Смена рабочей папки перед началом проведения измерений позволяет защитить результаты предыдущего эксперимента от удаления. Стандартное имя ScanData можно изменить, задав его в окне выбора рабочей папке. Вызов окна выбора рабочей папки происходит при нажатии кнопки , расположенной на панели инструментов главного окна программы. Сохранить результаты измерений можно также в окне Браузер сканов , поочередно выделяя необходимые файлы и сохраняя их в выбранной папке. Существует возможность экспорта результатов, полученных при помощи прибора NanoEducator в ASCII формат и формат Nova фирма НТМДТ , который может быть импортирован программой НТ МДТ Nova, Image Analysis и другими программами. В ASCII формат экспортируются изображения сканов, данные их сечений, результаты измерения спектроскопии. Для экспорта данных необходимо нажать кнопку Экспорт , расположенную в инструментальной панели главного окна программы, либо выбрать Экспорт в пункте меню Файл этого окна и выбрать соответствующий формат экспорта. Данные для обработки и анализа можно сразу послать в предварительно запущенную программу Image Analysis. После закрытия окна диалога на экран выводится панель управления прибором Рис. В левой части панели управления прибором расположены кнопки выбора конфигурации СЗМ:. Проведение измерений на учебном СЗМ NanoEducator заключается в выполнении следующих операций: Перед установкой образца необходимо снять датчик с зондом, чтобы не повредить зонд. Для установки образца на двусторонней липкой ленте, необходимо вывинтить держатель из стойки чтобы не повредить сканер , а затем вновь ввинтить его до легкого упора. В случае магнитного крепления замена образца может производиться без отвинчивания держателя образца. Устанавливать датчик с зондом следует всегда после установки образца. Эту операцию рекомендуется выполнять при верхнем положении держателя датчика. Датчик переводится в верхнее положение поворотом винта ручного подвода 1 по часовой стрелке. Выбрав нужный зондовый датчик держите датчик за металлические кромки основания см. При выборе на образце участка для исследования используйте винты перемещения двухкоординатного столика, расположенного в нижней части прибора. Операция предварительного подвода не является обязательной для каждого измерения, необходимость ее выполнения зависит от величины расстояния между образцом и острием зонда. Операцию предварительного сближения желательно производить, если расстояние между кончиком зонда и поверхностью образца превышает 0. При использовании автоматизированного подвода зонда к образцу с большого расстояния между ними процесс подвода займет очень много времени. Воспользуйтесь винтом ручного подвода для опускания зонда, контролируя расстояние между ним и поверхностью образца визуально. Построение резонансной кривой и установка рабочей частоты. Эта операция обязательно выполняется в начале каждого измерения и, пока она не произведена, переход к дальнейшим этапам измерений заблокирован. Кроме того, в процессе измерений иногда возникают ситуации, требующие повторного выполнения этой операции например, при потере контакта. Окно поиска резонанса вызывается нажатием кнопки панели управления прибором. Выполнение этой операции предусматривает измерение амплитуды колебаний зонда при изменении частоты вынужденных колебаний, задаваемых генератором. Для этого необходимо нажать кнопку RUN Рис. Окно операции поиска резонанса и установки рабочей частоты: В режиме Авто автоматически устанавливается частота генератора, равная частоте, при которой наблюдалась максимальная амплитуда колебаний зонда. График, демонстрирующий изменение амплитуды колебаний зонда в заданном диапазоне частот Рис. Если резонансный пик недостаточно ярко выражен, или амплитуда при частоте резонанса мала менее 1В , то необходимо изменить параметры проведения измерений и повторно провести определение резонансной частоты. Для этого предназначен режим Ручной. При выборе этого режима в окне Определение резонансной частоты появляется дополнительная панель Рис. Напряжение раскачки зонда , задаваемых генератором. Рекомендуется устанавливать эту величину минимальной вплоть до нуля и не более 50 мВ. Коэффициент усиления амплитуды Усиление амплитуды. Для начала операции поиска резонанса необходимо нажать кнопку Старт. Режим Ручной позволяет вручную менять выбранную частоту, передвигая зеленый курсор на графике с помощью мыши, а также уточнить характер изменения амплитуды колебаний в узком диапазоне значений вокруг выбранной частоты для этого необходимо установить переключатель Ручной режим в положение Точно и нажать кнопку Старт. Для захвата взаимодействия выполняется процедура контролируемого сближения зонда и образца с помощью механизма автоматизированного подвода. Окно управления этой процедурой вызывается нажатием кнопки панели управления прибором. При работе с ССМ эта кнопка становится доступной после выполнения операции поиска и установки резонансной частоты. Окно ССМ, Подвод Рис. В окне Подвод пользователь имеет возможность наблюдать за следующими величинами:. Величина относительного удлинения сканера характеризуется уровнем заполнения левого индикатора цветом, соответствующим зоне, в которой находится сканер в текущий момент: В последнем случае программа выдает звуковое предупреждение;. Величина относительной амплитуды колебаний зонда показана на правом индикаторе уровнем его заполнения бордовым цветом. Горизонтальная метка на индикаторе Амплитудой колебаний зонда указывает на уровень, при переходе через который производится анализ состояния сканера и его автоматический вывод в рабочее положение;. Подвод — сближение, Отвод — удаление. Убедиться, что параметр Подавление амплитуды Сила имеет величину около 0,2 см. В противном случае нажать кнопку Сила и в окне Установка параметров взаимодействия Рис. Для более деликатного подвода значение параметра Подавление амплитуды может быть меньше. Проверить правильность установок в окне параметров Параметры , страница Параметры подвода. Имеется взаимодействие или нет, можно определить по левому индикатору Сканер Z. Полное удлинение сканера весь индикатор Сканер Z окрашен синим цветом , а также полностью закрашенный бордовым цветом индикатор Амплитуда колебаний зонда Рис. После выполнения поиска резонанса и установки рабочей частоты амплитуда свободных колебаний зонда принимается за единицу. Если же сканер удлинен не полностью до или во время сближения, либо программа выдает сообщение: Зонд слишком близок к образцу. Проверьте параметры подвода или физический узел. Нажать на кнопку для медленного подвода. Окно установки величины взаимодействия зонда и образца. При необходимости осуществить сближение на один шаг, следует нажать кнопку. В этом случае сначала выполняется шаг, а потом осуществляется проверка критериев захвата взаимодействия. Для остановки движения необходимо нажать кнопку. Для выполнения операции отвода необходимо нажать кнопку для быстрого отвода. При необходимости осуществить отвод на один шаг, следует нажать кнопку. После выполнения процедуры подвода Подвод и захвата взаимодействия становится доступным сканирование кнопка в окне панели управления прибором. Нажав эту кнопку вид окна сканирования представлен на Рис. Перед проведением процесса сканирования необходимо установить параметры сканирования. Эти параметры сгруппированы в правой части верхней панели окна Сканирование. В первый раз после запуска программы они устанавливаются по умолчанию:. Количество точек измерений по осям - X, Y: Путь сканирования - Направление определяет направление сканирования. Программа позволяет выбирать направление оси быстрого сканирования Х или Y. При запуске программы устанавливается Направление. После задания параметров сканирования необходимо нажать кнопку Применить для подтверждения ввода параметров и кнопку Старт для начала сканирования. Окно управления процессом и отображения результатов сканирования ССМ. Прежде чем приступить к работе на сканирующем зондовом микроскопе NanoEducator следует изучить руководство пользователя прибора [Лит. Для питания прибора используется напряжение В. Эксплуатацию сканирующего зондового микроскопа NanoEducator производить в соответствии с ПТЭ и ПТБ электроустановок потребителей напряжением до В. Подготовьте самостоятельно биологические образцы для исследований методом СЗМ. Изучите на практике общую конструкцию прибора NanoEducator. Познакомьтесь с программой управления прибором NanoEducator. Получите первое СЗМ изображение под контролем преподавателя. Проведите обработку и анализ полученного изображения. Какие формы бактерий характерны для вашего раствора? Чем определяется форма и размеры бактериальных клеток? Возьмите Определитель бактерий Берджи и сравните полученные результаты с описанными там. Какие существуют методы исследования биологических объектов? Что такое сканирующая зондовая микроскопия? Какой принцип лежит в ее основе? Назовите основные компоненты СЗМ и их назначение. Что такое пьезоэлектрический эффект и как он применяется в СЗМ. Опишите различные конструкции сканеров. Опишите общую конструкцию прибора NanoEducator. Опишите датчик силового взаимодействия и принцип его действия. Опишите механизм подвода зонда к образцу в приборе NanoEducator. Поясните параметры, определяющие силу взаимодействия зонда с образцом. Объясните принцип сканирования и работы системы обратной связи. Расскажите о критериях выбора параметров сканирования. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. Под ред Егорова Н. Руководство пользователя прибора NanoEducator. Для более точной идентификации требуется применение дополнительных методов, например, биохимических тестов. Учебная программа по дисциплине 5 Программа Применение сканирующего зондового микроскопа для исследования биологических объектов. Сканирующая зондовая микроскопия в биологии" План лекций: В сканирующей зондовой микроскопии для Предварительная программа xxiii российской конференции по электронной микроскопии 1 июня вторник утро 10 00 — 14 00 открытие конференции вступительное слово Программа Попенко Применение зондовой и конфокальной сканирующей микроскопии для исследования процессов репарации с использованием нанодисперсных трансплантатов Применение сканирующего зондового микроскопа для исследования биологических объектов 1 7. Цели работы 2 7. Информация для преподавателя 3 7. Содержание работы 3 7. Методические указания 31 7. Техника безопасности 32 7. Контрольные вопросы 32 7.
Формы реализации конституционного права
Истории имен городов
Рюкзак arcteryx bora 65 описание