Просветление микробной взвеси было обусловлено лизисом, т. П ри дальнейшем изучении оказалось, что бактериофаг представляет собой разновидность вирусов, вызывающих поражение и гибель бактерий. Как и все вирусы, бактериофаги ведут паразитический образ жизни, хозяевами их являются бактерии. Размножение бактериофага возможно только в живых клетках, находящихся в стадии деления. В процессе размножения фагов были выявлены последовательные этапы:. Период от момента инфицирования клетки бактериофагом и началом ее лизиса называется латентным. Продолжительность его у одних фагов исчисляется минутами, у других - часами. При некоторых условиях бактериофаг, проникая в микробную клетку, включается в геном клетки и существует ней, не вызывая лизиса — лизогения - симбиоз микробной клетки с фагом, культуры, которые содержат фаг, не лизируясь - лизогенные. Лизогенные культуры устойчивы к фагу, который они несут. А фаги, находящиеся в лизогенных бактериях, получили название умеренных. Вирулентные фаги вызывают лизис культуры микробных клеток и освобождение размножившегося фага. Связь, имеющаяся между фагом и лизогенной культурой, стойко передается по наследству. Специфичность различных фагов выражена неодинаково: В практике микробиологии специфичность моновалентных фагов используют для определения видов микробов. Резко выраженные избирательные свойства типовых фагов позволяют разделить микробов одного и того же вид на различные фаготипы. В естественных условиях фаготип бактерий характеризуется большой стабильностью. После выявления бактериофага в исследуемом материале необходимо определить его количественное содержание или, как принято говорить, найти титр фага. Для выражения титра бактериофага можно пользоваться двумя показателями: Полученную при этом величину выражают отрицательным логарифмом 10, где степень указывает разведение фага. Средний титр бактериофага составляет Для титрования бактериофага предложены различные методы, однако наибольшее распространение получили способ титрования фага в жидкой питательной среде, предложенный Аппельманом, и метод агаровых слоев Грациа. Титрование бактериофага в жидкой питательной среде по методу Аппельмана. Метод Аппельмана основан на внесении различных количеств титруемого бактериофага в бульон, засеянный одной и той же дозой культуры гомологичных микробов, с целью получения феномена бактериофагии. Двенадцать пробирок, содержащих по 4,5 мл мясопептонного бульона, ставят в штатив в один ряд. В 1-ю пробирку стерильной пипеткой вносят 0,5 мл исследуемого фага. Содержимое пробирки перемешивают и 0,5 мл жидкости из 1-й пробирки переносят во 2-ю, из 2-й - в З-ю и т. Из й пробирки лишние 0,5 мл выливают, я и я пробирки контрольные. Переносят жидкость из одной пробирки в другую каждый раз отдельной стерильной пипеткой емкостью 1 мл. Таким образом, в 10 пробирках получают разведения бактериофага от 1: Во все 10 пробирок приготовленного ряда разведений вносят по 0,2 мл 18—часовой бульонной культуры бактерий, одноименных титруемому фагу. Прибавляемая культура не должна содержать устойчивых к фагу клеток. Густота микробной взвеси, прибавляемой в пробирки с титруемым бактериофагом, существенного значения не имеет, так как опытным путем было установлено, что изменение микробной концентрации в пределах —4 в 1 мл не оказывает заметного влияния на исход титрования бактериофага. Пробирка я — контроль культуры, содержит 5 мл бульона и 0,2 мл бульонной культуры микробов. Пробирка я - контроль на стерильность, содержит 5 мл бульона без добавления культуры и фага. Титром считают то максимальное разведение бактериофага, при котором наблюдается полный лизис чувствительной к нему культуры. Практически это соответствует той последней пробирке в ряду, в которой бульон еще остается совершенно прозрачным. FAQ Обратная связь Вопросы и предложения. В процессе размножения фагов были выявлены последовательные этапы: Соседние файлы в папке Методички на первый семестр
Экспресс-поиск по номеру патента New! По разделам МПК международной патентной классификации:. Способ может быть использован при получении лечебно-профилактических бактериофагов, предназначенных для парантерального и внутривенного введения. Фаголизат подвергают микрофильтрации через мембраны для удаления детрита и клеток. В осветительный фаголизат вводят комплексообразователь или детергент. Концентрируют фаголизат ультрафильтрацией через мембраны с порогом задержания - КДа. Затем проводят диафильтрацию против раствора комплексообразователя или детергента со сменой трех объемов физиологически приемлемого буфера. Расширение диапазона планируется в ближайшее время. По номеру патента и году публикации По разделам МПК международной патентной классификации: Изобретение относится к биотехнологии, а именно к производству медицинских биологических препаратов и может быть использовано при получении лечебно-профилактических бактериофагов, предназначенных для парентерального и внутривенного введения. Препараты бактериофагов оказывают непосредственное литическое действие на микробные клетки терапевтическое в отличие от вакцин, требующих длительного иммунологического процесса для профилактики инфекции. Известные способы получения бактериофагов [1 и 2] позволяют получать препараты бактериофагов, пригодных только для местного и энтерального применения per os. Однако энтеральный способ применения эффективен в основном при локализации инфекции в желудочно-кишечном тракте, а местное применение бактериофагов обеспечивает поступление препарата лишь в поверхностные ткани, что снижает эффективность препарата лишь в поверхностные ткани, что снижает эффективность лечения. Более эффективные способы введения бактериофагов - подкожный, внутримышечный, внутривенный, внутриполостной - не могут быть применены из-за побочных реакций, связанных с пирогенностью препаратов и анафилактоидными свойствами остатков питательной среды. Поэтому в действующих фармакопейных статьях [3] на эти препараты предусмотрено только два пути введения - местный и энтеральный. Известны способы удаления балластных веществ остатков питательной среды, белков, метаболитов бактерий из полуфабриката бактериофагов, например, ультрафильтрацией [2]. Однако предлагаемые способы неэффективности в отношении устранения пирогена эндотоксинов, липополисахаридов , хотя и обеспечивают удаление части белка и балластных веществ [2 и 4]. Кроме того, в литературе имеются сведения об опыте получения стафилококкового бактериофага для парентерального применения, однако его получение связано со сложным технологическим процессом и не нашло промышленного применения [5]. Наиболее близким техническим решением к предлагаемому способу получения бактериофагов для парентерального применения является способ выделения бактериофагов [4] , включающий микрофильтрацию фаголизатов известных фагов с последующей ультрафильтрацией и стерилизующей фильтрацией. Задача изобретения - разработка способа получения препаратов бактериофагов, пригодных для парентерального введения. Общими признаками для этих способов является микрофильтрация фаголизатов, процесс ультрафильтрации на мембранах и заключительная стерилизующая фильтрация. Отличительными признаками предлагаемого способа получения бактериофагов для парентерального введения является применение на этапе ультрафильтрации детергентов или комплексообразователей и использование мембран с большим порогом задержания по молекулярной массе от до КДа прототип КДа. Введение детергентов или комплексообразователей на этапе ультрафильтрации облегчает прохождение сквозь мембрану с большим диаметром пор в фильтрат молекул эндотоксинов, денатурированных белков, липополисахаридов ЛПС , метаболитов бактерий и питательной среды. Частицы фага, задерживаясь мембраной, переводятся в физиологически приемлемый буфер, свободный от эндотоксинов. Тем самым происходит очистка бактериофагов от пирогена, причем возможна очистка фагов как грамотрицательных, так и грамположительных бактерий. Наличие пирогенности в последних, видимо, можно объяснить наличием эндотоксинов в питательной среде, на оборудовании, реактивах. Как видно из таблицы, использование вновь предлагаемого способа позволяет: Препараты бактериофагов, полученные предлагаемым способом, не обладали токсическими свойствами при внутрибрюшинном введении белым мышам в дозе, в раз превышающей максимально разовую для человека. Гибели животных, падения массы тела, патологических изменений внутренних органов не обнаружено. Препараты бактериофагов, полученные предлагаемым способом, не обладали токсическими свойствами при внутрибрюшинном введении в терапевтических дозах в течение 21 дня хроническая токсичность. Пирогенность бактериофагов оценивалась согласно Государственной Фармакопее СССР, 11 издание, вып. Предлагаемый способ позволяет провести депирогенизацию практически всех видов бактериофагов, а контактирование детергентов или комплексообразователей с бактериофагами не приводило к разрушению или потере литической активности фаговых частиц или нарушению стабильности бактериофагов во время хранения. Приведенная совокупность отличительных признаков способа в данной комбинации в литературе не описана, а их влияние на достижение технического результата не следует из известного уровня техники. Предложенное техническое решение обеспечивает достижение технического результата и может быть реализовано в технологии получения бактериофагов. Способ осуществляют следующим образом. Фаголизат подвергают микрофильтрации через мембраны 0,2 мкм для удаления детрита и клеток. Затем проводят заключительную стерилизующую фильтрацию. Фаголизат дизентерийного бактериофага Зонне S 1 фильтруют через фильтр-картон, затем через капроновые мембраны с размером пор 0,2 мк в тангенциальном потоке. В фаголизат для устранения пирогена добавляют ЭДТА до концентрации 2 мМ и концентрируют ультрафильтрацией в 10 раз по объему через мембраны УПМ, Да, ПО "Тасма", Казань в режиме тангенциального потока. Затем проводят диафильтрацию в постоянном объеме тремя объемами стерильного апирогенного 0,15 М раствора NaCl, содержащего 2 мМ ЭДТА. Далее удаляют ЭДТА диафильтрацией в постоянном объеме со сменой 3 объемов 0,15 М раствора NaCl. Полученный диафильтрат разводят до исходного объема 10 л 0,15 М раствором NaCl. Очищенный по известному способу препарат оказался пирогенным: Фаголизат бактериофага Staphylococcus aureus фильтруют через фильтр-картон. Затем через капроновые мембраны с размером пор 0,2 мк в тангенциальном потоке. В профильтрованный фаголизат добавляют ЭДТУК до концентрации 10 мМ и концентрируют ультрафильтрацией в 5 раз по объему через полисульфоновые мембраны Да Sartorlus AG, Germany в режиме тангенциального потока. Затем проводят диафильтрацию в постоянном объеме тремя объемами стерильного 0,15 М раствора трис-буфера, содержащего 10 мМ ЭДТУК. Далее удаляют ЭДТУК диафильтрацией в постоянном объеме со сменой 5 объемов 0,15 М NaCl. Полученный диафильтрат разводят до исходного объема 10 л диафильтрующим раствором. Очищенный по известному способу препарат пирогенен: Фаголизат бактериофага Streptococcus enterococcus фильтруют через фильтр-картон. Затем через капроновые мембраны с размером пор 0,2 мк с тангенциальном потоке. В профильтрованный фаголизат добавляют ЭДТУК до концентрации 0,03 М и концентрируют ультрафильтрацией в 10 раз по объему через полисульфоновые мембраны РТМК Да Mllllpore, USA в режиме тангенциального потока. Затем проводят диафильтрацию в постоянном объеме тремя объемами стерильного раствора, содержащего 0,14 М NaCl, 0, М LH 2 PO 4 , 0, M Na 2 HPO 4 , 0,03 М ЭДТУК. Далее комплексообразователь удаляют диафильтрацией в постоянном объеме со сменой 5 объемов диафильтрующего раствора без ЭДТУК. Фаголизат синегнойного бактериофага Pseudomonas aeruglnosa фильтруют через фильтр-картон. Далее удаляют детергент диафильтрацией в постоянном объеме со сменой 3 объемов 0,15 М раствора NaCl. Фаголизат протейного бактериофага Proteus vulgarls фильтруют через фильтр-картон. Далее удаляют детергент диафильтрацией в постоянном объеме сменой 5 объемов 0,15 М раствора NaCl. Внедрение препаратов бактериофагов пригодных для парентерального применения позволит практическому здравоохранению расширить показания к применению и повысить эффективность препарата. Использованные литературные источники 1. Регламент производства пиобактериофага комбинированного жидкого N Патент РФ N , кл. Бактериофаг стафилококковый жидкий Бактериофаг стрептококковый жидкий Бактериофаг Pseudomonas aeruglnosa синегнойный жидкий Бактериофаг сальмонеллезных групп ABCDE жидкий и сухой с кислотоустойчивым покрытием BC Бактериофаг дизентерийный поливалентный жидкий ВФС Опыт получения лечебного ареактивного препарата стафилофага на ПСС для внутривенного введения и изучение продукции экзотоксинов стафилококка в процессе фаголизиса. Материалы юбилейного симпозиума, посвященного летию Тбилисского НИИВС. Теоретические и практические вопросы бактериофагии, Тбилиси, , - Государственная фармакопея СССР, 11 издание, вып. Способ выделения бактериофагов микрофильтрацией с последующей ультрафильтрацией и стерилизующей фильтрацией, отличающийся тем, что ультрафильтрацию проводят на мембранах с порогом задержания - КДа в присутствии комплексообразователей или детергентов с последующей диафильтрацией физиологически приемлемым буфером.
https://gist.github.com/90fe466075fb8c1b954133922209462d
https://gist.github.com/91f60f11c03f9397e1460319563afa9d
https://gist.github.com/e3d23118e641581243c517b1004fe22c